一种控制猪PFKM表达的载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种重组载体，所述载体包括sgRNA的编码基因和Cas9蛋白编码基因，所述sgRNA的靶位点为序列1所示的DNA。本发明专利技术提供一种用于控制猪PFKM表达的载体，通过所述载体能够控制猪细胞中的PFKM表达量，进而控制猪的肌肉的纤维组成，调节瘦肉率的变化。

A vector for controlling pfkm expression in pigs and its application

【技术实现步骤摘要】
一种控制猪PFKM表达的载体及其应用
本专利技术涉及生物
，涉及猪CRISPR/Cas9基因敲除质粒载体的构建。
技术介绍
肌型磷酸果糖激酶(PFKM)是在骨骼肌中广泛表达的一类调节酶，它也是糖酵解的一个关键调节酶，是糖酵解中起决定作用的限速酶，其分子是一个四聚体形式。其功能和表达量的变化会通过调节靶基因的表达，改变肌肉的纤维组成(红、白肌的比例)及造成瘦肉率变化。该基因的表达抑制有助于研究该基因的功能。gRNA长度约为80个核苷酸，包含两个区域：gRNA5’端前20个核苷酸对应于靶标DNA，能结合在靶标DNA上，其中含有一PAM结构，能与由任意核苷酸序列(N)+5’末端两个胞嘧啶核苷酸(-NCC)的DNA结合，即-NGG。剩余的约60个核苷酸形成一个发卡，此结构能帮助gRNA与Cas9结合，并由此指导与DNA的结合。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种控制猪PFKM表达的载体及相应的PFKM基因敲除细胞株。本专利技术提供一种重组载体，所述载体包括sgRNA的编码基因和Cas9蛋白编码基因，所述sgRNA的靶位点为序列1所示的DNA。其中，所述sgRNA为序列2所示的RNA。其中，所述sgRNA的编码基因的编码序列为序列3。其中，所述重组载体是在P1质粒的Bbsl识别位点处插入所述sgRNA的编码基因，并保持所述PI质粒的其他核苷酸不变的重组载体，包括pYSY、CMV、U6、EF1a和Puromycin；所述重组载体是在P1质粒的Bbsl识别位点处插入所述sgRNA的编码基因，并保持所述PI质粒的其他核苷酸不变的重组载体。其中，所述重组载体的核苷酸序列为序列4。其中，所述重组载体为用于敲低猪PFKM基因表达的载体。本专利技术涉及一种敲低猪细胞中PFKM基因表达的方法，包括将所述的控制猪PFKM基因表达的载体，导入猪细胞中，得到PFKM基因表达量降低的重组猪细胞。本专利技术还要求保护下述任一应用：X1、所述载体在控制PFKM基因表达中的应用；X2、所述载体在制备控制PFKM基因表达的动物模型中的应用；X3、所述载体在动物育种中的应用；X4、所述的方法在制备控制PFKM基因表达的动物模型中的应用；X5、所述的方法在动物育种中的应用。本专利技术提供一种用于控制猪PFKM表达的载体，通过所述载体能够控制猪细胞中的PFKM表达量，进而控制猪的肌肉的纤维组成，调节瘦肉率的变化。附图说明图1为重组载体酶切鉴定图图2为双酶切质粒电泳图图3为96孔板中单个细胞孔图；图4为96孔板中单细胞克隆图；图5为细胞敲除株2株的测序峰图；图6为细胞敲除株4株的测序峰图；图7为各组敲除细胞株总RNA电泳图；图8为QRT-PCR检测CRISPR/Cas9敲除后的PFKM表达图；图9为PFKM蛋白表达检测图；图10为质粒pYSY-CMV-Cas9-U6-PFMK-sgRNA-EFla-Puromycin的结构图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。一、CRISPR/Cas9基因敲除质粒的设计、合成及鉴定1.设计与合成互补引物根据PFKM序列结构特点设计CRISPR序列，引物合成公司合成对应的互补引物。PFKM-Oligo序列：F-PFKM：CACCGTGTCACCTCTCTCTCCTGTG，R-PFKM：AAACCACAGGAGAGAGAGGTGACAC。2.引物退火:按照表1中的比例配置溶液，将溶液混合于PCR管内，在PCR仪中以每分钟1.5℃逐渐从95℃降至22℃，得到退火产物。表1.引物退火溶液3.连接：将表2中的溶液混合于1.5mlEP管中，室温孵育30min，得到PFKMsgRNA的编码DNA序列，所述PFKMsgRNA的编码序列为序列表中序列3所示的DNA序列。表2.4.转化将步骤3得到的PFKMsgRNA的编码序列插入到YSY线性化CRISPR/Cas9质粒(质粒购自南京尧顺禹生物科技有限公司)的U6启动子下游并由U6启动子启动PFKMsgRNA的编码序列的转录，并保证YSY线性化CRISPR/Cas9质粒的其他不符序列不变的重组质粒，所述重组质粒命名为pYSY-CMV-Cas9-U6-PFMK-sgRNA-EFla-Puromycin。将10μl的重组质粒pYSY-CMV-Cas9-U6-PFMK-sgRNA-EFla-Puromycin用50μl大肠杆菌DH5α(购自TAKARA公司)感受态细胞(pfu≥108)进行转化，然后涂布于含氨苄(50μg/ml)(购自Solarbio公司，货号：A8180)的LB板，37℃下倒置培养过夜。5.转化子验证5.1PCR模板的快速制备用10μl无菌枪头随机挑选17个克隆(步骤几中的)，放入含20μlLB的EP管中，合盖后快速涡旋混匀，用作PCR的模板。5.2PCR验证体系(10μl)如表3所示。表3.5.3PCR反应条件：95℃3min；30×(95℃30s，55℃30s，72℃30s)；72℃10min，4℃。5.4将步骤5.1中的模板按照步骤5.2中的反应体系和步骤5.3中的反应条件进行PCR，得到PCR验证阳性克隆电泳图如图1所示，自左向右第9泳道为DNAMarker：从下向上条带依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、5000bp；图中约100bp条带的为阳性克隆。(其中，图1中从左至右的1-17分别表示代表随机挑选的17个克隆。)5.5转化子的测序验证将之前验证正确的阳性克隆菌液送至金斯瑞生物技术有限公司测序，测序比对结果如图2所示，图2中，上方的序列为预期的sgRNA的编码基因的序列，下方的序列为阳性克隆的菌液的测序结果，比对结果表明，目标质粒中含有sgRNA序列，目标质粒构建成功。5.6pYSY-CMV-Cas9-U6-PFKM-sgRNA-EFla-Puromycin质粒在猪细胞内预计的sgRNA转录本序列为：GUGUCACCUCUCUCUCCUGUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuu。6.CRISPR/Cas9基因敲除质粒的提取及鉴定6.1质粒提取本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组载体，其特征在于：所述载体包括sgRNA的编码基因和Cas9蛋白编码基因，所述sgRNA的靶位点为序列1所示的DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组载体，其特征在于：所述载体包括sgRNA的编码基因和Cas9蛋白编码基因，所述sgRNA的靶位点为序列1所示的DNA。


2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述sgRNA为序列2所示的RNA。


3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：所述sgRNA的编码基因的编码序列为序列3。


4.根据权利要求1-3任一所述的载体，其特征在于：所述重组载体是在P1质粒的Bbsl识别位点处插入所述sgRNA的编码基因，并保持所述PI质粒的其他核苷酸不变的重组载体，包括pYSY、CMV、U6、EF1a和Puromycin。
所述重组载体是在P1质粒的Bbsl识别位点处插入所述sgRNA的编码基因，并保持所述PI质粒的其他核苷酸不变的重组载体。


5.根据权利要求1-4任...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠辉明，许金蔓，杨跃飞，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32