本发明专利技术涉及一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法，将待串联的n个sgRNA分别插入相应的42230载体；通过PCR扩增，扩增出sgRNA2的表达框，然后通过无缝克隆在第一个sgRNA1表达载体上的EcoR I位点实现第二个sgRNA2表达框的插入，得到同时表达2个sgRNA的载体；然后通过PCR扩增，扩增出sgRNA3的表达框，然后通过无缝克隆在42230-sgRNA1+2上的EcoR I位点实现第三个sgRNA3表达框的插入，得到同时表达3个sgRNA的载体，依次操作，即得。本发明专利技术可以同时实现基因家族成员的同时敲除，解决了现有方法的不足。
【技术实现步骤摘要】
[00011本专利技术属于CRISPR/Cas9系统的sgRNA领域，特别涉及一种同时表达多个sgRNA的 载体的构建方法。
技术介绍
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，成族 调控的间隔短串联重复序列)起源于细菌和古细菌的免疫系统，是目前使用最为广泛的基 因编辑工具，已经成功运用于大肠杆菌，酵母，小鼠，人等物种的基因组编辑。 根据CRISPR在降解靶基因过程中指导RNA和CRISPR结合核酸酶的不同，CRISPR系 统被分为三类。其中，以Cas9(CRISRP-associated)为核酸酶的二型应用最多（Patrick D.Hsu,Eric S.Lander,and Feng Zhang.Development and Applications of CRISPR-Cas9for Genome Engineering-Cell 157，1263_1278(2014))〇 对CRISPR行使功能的重要元件的鉴定与优化，为CRISPR系统的应用奠定了基础。 Jinek等人在体外实验中证实CRISPR功能的实现依赖于4个重要的功能元件：tracrRNA, crRNA，Cas9以及PAM。经过Cong L等人的进一步探索，一个能够自身形成二级结构结合Cas9并实现位点 特异性切割的sgRNA(single guide RNA)和人源密码子优化的Cas9表达载体pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(42230，addgene)成功构建。自此，使用 CRISPR系统编辑基因组变得更加灵活方便。 CRI SPR的出现简化了之前的基因编辑工具(ZFN，TALEN)复杂的制备过程。正因为 如此便捷的操作过程节约的大量的时间和成本，使用CRISPR进行高通量的基因编辑逐渐成 为研究热点。最初Wang等人同时使用5种sgRNA转染小鼠胚胎干细胞，基因分型结果显示，该 方法可以实现多个基因的同时编辑。为了提高转染sgRNA在细胞中分布的均一性，即 在同一细胞中同时实现多种基因的编辑，陆续有研究着眼于构建同时插入多个sgRNA的表 达框的载体。Kabadi等人通过改造已有的sgRNA表达载体，获得4种含有sgRNA插入位点的亚 克隆，这些亚克隆的sgRNA表达框的两端分别带有BsmBI酶切位点。由于BsmBI酶识别与切 害J位点的特殊性，通过对识别位点与切割位点之间粘性末端的设计，可实现4种sgRNA以次 序的连接，即Golden Gate克隆方法，他们成功实现4个sgRNA的串联表达。与他们构建思路相同，Sakuma等人改造现有的42230质粒， 构建了7种带有sgRNA插入位点的亚克隆载体:第1个亚克隆载体在sgRNA表达框的后面插入 两个Bsal酶切位点，其他6个载体则是在sgRNA表达框两端分别引入不同Basl酶切位点，同 样采用Golden Gate克隆方法，7个亚克隆经过Basl切割后产生的粘性末端首尾相接，由此 实现7中sgRNA的串联〇比 较现存基于Golden Gate的sgRNA串联表达方法可以发现，这些方法所能实现sgRNA串联表 达的数目受限于sgRNA插入质粒亚克隆的数目。因此，不依赖于Golden Gate以更灵活的方 法实现sgRNA表达的方案仍有待进一步探索。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供， 本专利技术提供了一种能够在哺乳动物细胞中同时表达多个sgRNA的载体构建方案。在实际应 用中，可根据研究需要，灵活串联所需sgRNA。在对基因家族功能的研究中，该方案可以同时 实现基因家族成员的同时敲除;在miRNA功能研究中，两个sgRNA同时作用于其编码区域两 端，以实现整个miRNA的敲除。总之，本专利技术为基因功能研究提供便利。 本专利技术的，包括： (1)将待串联的η个SgRNA分别插入相应的42230载体，得到η个SgRNA表达载体 42230-sgRNA n;其中n=l、2、3、4···的正整数； (2)以Multi-sgRNA Fl、Multi-sgRNA R为引物，通过PCR扩增，从第二个SgRNA表达 载体42230-sgRNA2上扩增出sgRNA 2的表达框，然后通过无缝克隆在第一个881?嫩1表达载体 42230-sgRNAi上的EcoR I位点实现第二个sgRNA2表达框的插入，得到重组载体42230-sgRNAi+2 ； (3)以Multi-sgRNA F2、Multi-sgRNA R为引物，然后通过PCR扩增，从第三个sgRNA 表达载体42230-sgRNA3上扩增出sgRNA3的表达框，然后通过无缝克隆在42230-sgRNA 1+2上的 EcoR I位点实现第三个sgRNA3表达框的插入，得到重组载体42230-sgRNA1+2+3,然后将 sgRNA4的表达框通过无缝克隆在EcoR I位点实现第四个sgRNA4表达框的插入，依次操作， 即得同时表达多个sgRNA的载体42230-sgRNA1+2+3_ +n;其中42230-sgRNAn，其中n>2的表达 框的扩增所有引物均为Multi-sgRNA F2、Multi-sgRNA R为引物。 所述步骤(2)、（3)中无缝克隆通过无缝克隆试剂盒进行。 所述步骤（1)中n = 4，4个 SgRNA 表达载体分别为：42230-sgRNAi: 42230-miR-505， 42230-sgRNA2:42230-miR-29a，42230-sgRNA 3:42230-miR-29c，42230-sgRNA4:42230-SF2。 所述步骤(2)中 Multi-sgRNA F1:AGGCAAAAAAGAAAAAGTAATTACGGTTCCTGGCCTTTTG;如SEQ ID NO.1 所示； Multi-sgRNA R: CGAGCTCTAGGAATTCTTTGTCTGCAGAATTGGCGC，如SEQ ID Ν0· 2所示。 所述步骤⑶中 Multi-sgRNA F2:GCGCCAATTCTGCAGACAAATTACGGTTCCTGGCCTTTTG;如SEQ ID N0.3 所示； Multi-sgRNA R: CGAGCTCTAGGAATTCTTTGTCTGCAGAATTGGCGC，如SEQ ID NO.4所示。 Multi-sgRNA F2、Multi-sgRNA R能扩增所有42230-sgRNAn，n>2的表达框。 步骤(2)、（ 3)中的重组载体均进行菌落PCR验证，然后选取菌落PCR呈阳性的菌落 进程测序验证。 重组载体进行菌落PCR验证，然后选取菌落PCR呈阳性的菌落进程测序验证具体 为:将重组载体转化进DH5a，过夜培养后从平板上挑取单克隆以Seq-F和Seq-R为引物进行 菌落PCR验证sgRNAn的插入，然后选取菌落PCR呈阳性的菌落，以Seq-R为引物进行测序验 证，重组质粒中测序检测到插入sgRNAn的序列为正确的菌落的质粒。 所述引物Seq_F:GATCGACCTGTCTCAGCTGG如SEQ ID N0.5所示；Seq-R: GCAACT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法，包括：(1)将待串联的n个sgRNA分别插入相应的42230载体，得到n个sgRNA表达载体42230‑sgRNAn；其中n＝1、2、3、4…的正整数；(2)以Multi‑sgRNA F1、Multi‑sgRNA R为引物，通过PCR扩增，从第二个sgRNA表达载体42230‑sgRNA2上扩增出sgRNA2的表达框，然后通过无缝克隆在第一个sgRNA1表达载体42230‑sgRNA1上的EcoR I位点实现第二个sgRNA2表达框的插入，得到重组载体42230‑sgRNA1+2；(3)以Multi‑sgRNA F2、Multi‑sgRNA R为引物，然后通过PCR扩增，从第三个sgRNA表达载体42230‑sgRNA3上扩增出sgRNA3的表达框，然后通过无缝克隆在42230‑sgRNA1+2上的EcoR I位点实现第三个sgRNA3表达框的插入，得到重组载体42230‑sgRNA1+2+3，然后使用同一对引物将扩增到的sgRNA4的表达框通过无缝克隆在EcoR I位点实现第四个sgRNA4表达框的插入，依次操作，即得同时表达多个sgRNA的载体42230‑sgRNA1+2+3.。。+n。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周宇荀，李晓宁，李文文，王斯佳，肖君华，李凯，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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