一种蜜蜂肽表达载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种蜜蜂肽表达载体及其构建方法和应用。构建方法包括如下步骤：1)合成含编码NTEV蛋白酶的表达操纵子基因；2)合成含编码木聚糖酶与蜜蜂肽的融合蛋白表达操纵子基因；3)分别对步骤1)和2)的表达操纵子基因进行双酶切，构建入载体pBluescriptⅡSK(+)，得到重组质粒；4)提取枯草芽孢杆菌168的基因组DNA，扩增其启动子p43，采用T载体克隆得到含启动子基因质粒，构建入质粒pGJ103，得到质粒pGJ284；通过反向PCR得到含p43启动子部分基因序列的高效启动子序列基因，构建入质粒pGJ284，得到质粒pGJ288；5)分别对上述重组质粒和质粒pGJ288进行双酶切，回收酶切产物后连接，得到蜜蜂肽表达载体。该表达载体表达量高，并且蜜蜂肽的提取方法简便，适合工业化大规模制备。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种表达载体的构建方法，特别是涉及一种蜜蜂肽表达载体及其构建方法和应用。
技术介绍
蜜蜂肽(apidaecin，简称AP)是一类来源于膜翅目昆虫的富脯氨酸的多肽，最早从蜜蜂的淋巴液中分离得到，一般含有16～18个氨基酸残基，其对多种革兰氏阴性菌，特别是肠杆菌科，具有很强的伤杀作用，而对包括乳酸乳球菌在内的革兰氏阳性菌不起作用，并且对真核细胞没有毒性作用，因此在食品和饲料添加剂、医药工业和植物抗细菌病基因工程上有着广阔的应用前景。由于蜜蜂肽在昆虫中的含量较少，直接从昆虫淋巴中纯化蛋白成本较高，不利于工业化生产，因此人们日渐尝试在不同的表达系统中对蜜蜂肽进行表达，例如大肠杆菌和酵母等表达系统。然而，抗菌肽在外源基因表达中存在基因表达量低、表达产物易降解、表达产物活性低、抗菌肽易对宿主菌产生毒害等问题。近年来，随着泛素融合技术在多种外源基因表达中的应用，也有将泛素基因与蜜蜂肽融合后在乳酸乳球菌中进行表达的相关报道。然而，该表达系统表达量较低本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蜜蜂肽表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)合成含编码NTEV蛋白酶的表达操纵子基因；2)合成含编码木聚糖酶与蜜蜂肽的融合蛋白表达操纵子基因；3)分别对所述步骤1)和步骤2)的表达操纵子基因进行双酶切，然后构建入载体pBluescriptⅡSK(+)，得到重组质粒；4)提取枯草芽孢杆菌168的基因组DNA，扩增其启动子p43，采用T载体克隆得到含启动子基因质粒，构建入质粒pGJ103，得到质粒pGJ284；通过反向PCR得到含p43启动子部分基因序列的高效启动子序列基因，构建入质粒pGJ284，得到质粒pGJ288；5)分别对所述步骤3)的重组质粒和步骤4)的质粒pGJ288进...

【技术特征摘要】
1.一种蜜蜂肽表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)合成含编码NTEV蛋白酶的表达操纵子基因；
2)合成含编码木聚糖酶与蜜蜂肽的融合蛋白表达操纵子基因；
3)分别对所述步骤1)和步骤2)的表达操纵子基因进行双酶切，然后
构建入载体pBluescriptⅡSK(+)，得到重组质粒；
4)提取枯草芽孢杆菌168的基因组DNA，扩增其启动子p43，采用T
载体克隆得到含启动子基因质粒，构建入质粒pGJ103，得到质粒pGJ284；
通过反向PCR得到含p43启动子部分基因序列的高效启动子序列基因，构建
入质粒pGJ284，得到质粒pGJ288；
5)分别对所述步骤3)的重组质粒和步骤4)的质粒pGJ288进行双酶切，
回收酶切产物后采用T4DNA连接酶连接，得到蜜蜂肽表达载体。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)的表达
操纵子基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)的表达
操纵子基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：武刚，祝发明，刘文庆，朱剑，
申请(专利权)人：张掖奥谱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：甘肃;62