用于检测雌激素化合物的重组酵母及其构建方法技术

本发明专利技术公开了用于检测雌激素化合物的重组酵母及其构建方法。本发明专利技术提供的一种重组菌，为在酿酒酵母中表达雌激素受体β基因、抗性筛选基因表达盒、3个串联ERE基因和报告基因表达盒，得到的重组菌。利用本发明专利技术方法所构建的重组酵母在雌激素类化合物存在时，可稳定高效合成GFP，GFP的表达量与雌激素类化合物的浓度呈正比，17β雌二醇的EC50为3.25pM，比现有文献报道提高约20倍。本发明专利技术为快速、灵敏地检测环境中雌激素类化合物奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
用于检测雌激素化合物的重组酵母及其构建方法
本专利技术属于生物
，涉及用于检测雌激素化合物的重组酵母及其构建方法。
技术介绍
雌激素类化合物是指所有具有雌激素活性的化合物，是一类重要的环境内分泌干扰物，种类繁多，结构多样。环境中的雌激素通过污染水、土壤、空气而进入生物链，在生物链富集、放大，通过饲料、饮水、空气等途径在畜禽体内富集、放大，危害家畜的生产繁殖性能以及危害动物性食品安全。该类化合物可与下丘脑、垂体、子宫等脏器的雌激素受体结合，对生殖发育过程、内分泌系统、癌症发生机制产生不利的影响，也威胁到生物种族的存亡。随着人们对环境内分泌干扰物危害作用的认识不断深入，控制、防治内分泌干扰物对人群健康的影响己成为当务之急，而准确地甄别、评价内分泌干扰物是首先需要解决的关键问题之一。目前己建立的环境雌激素干扰物的检测方法主要有：体内试验方法(包括子宫增重试验、阴道细胞角化试验)和体外试验方法(包括受体竞争结合试验、细胞增殖试验、雌激素调控内源性基因的表达、受体转录激活试验)。从目前已建立的体外、体内检测方法来看，由于外源性化学物在体内产生内分泌干扰效应的机制十分复杂，涉及诸多环节，因此整体动物试验具有相对的准确性和权威性，但同时往往操作过程复杂、费时费力，不适用于高通量筛选以及现场应用，并且现有的检测方法大多数敏感性较低而特异性偏高，因此建立快速、简便、经济、可靠，并可实现高通量筛选的体外检测系统是目前该领域研究和发展的主要方向之一。体外雌激素受体转录激活试验是近年来建立的一种测评方法。研究表明雌激素与雌激素受体(ER)在细胞核结合形成二聚体，增强雌激素受体与靶基因启动子区域中作为顺式调控元件的雌激素效应元件ERE特异性结合能力，二聚化的雌激素受体复合物再结合位于目标基因启动子的雌激素效应元件(EREs)，激活靶基因的转录表达，从而发挥作用。该方法根据上述的激素在受体介导下调控靶基因转录表达的作用机制，构建能够表达雌激素受体、并带有雌激素反应元件及其所调控的报告基因的酵母或哺乳动物细胞系统，通过检测报告基因的表达水平评估受试物的雌激素样作用的强弱。宿主细胞可以选用酵母或哺乳动物细胞，酵母系统的优点是酵母本身不具有内源性类固醇激素及激素受体系统，且培养基中也无需加入血清，因此排除了内源性激素的干扰作用；酵母表达产物与天然蛋白有极为相似的生物活性；并且酵母所表达的激素受体是人为转化到细胞中的，因此排除了体内受体基因突变可能对结果产生的影响。但是，目前已构建的重组酵母细胞检测体系对雌激素类化合物的敏感性偏低。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种重组菌。本专利技术提供的重组菌，为在酵母中表达雌激素受体β基因和含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒，得到的重组菌。所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒依次包括所述3个串联ERE基因、驱动报告基因表达的启动子和所述报告基因。上述重组菌中，所述重组菌中还表达抗性基因表达盒；所述3个串联ERE基因的核苷酸为序列表中序列4第1815‐1853位；或，所述驱动报告基因表达的启动子为部分ADH1；所述部分ADH1的核苷酸序列为序列4第1860‐2269位。上述重组菌中，所述在酵母中表达雌激素受体β基因为将所述雌激素受体β基因以重组载体的方式导入所述酵母中进行表达；或，所述在酵母中表达雌激素受体β基因、抗性筛选基因表达盒和含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒为将同源重组片段整合到所述酵母基因组中进行表达；所述同源重组片段包括所述抗性筛选基因表达盒和所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒的片段。上述重组菌中，所述重组载体为将所述雌激素受体β基因插入表达载体中，且表达所述雌激素受体β基因的载体；所述重组载体中，驱动所述雌激素受体β基因表达的启动子为序列表中序列2或序列4所示的DNA分子；或所述整合均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；或所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；或所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。上述重组菌中，所述雌激素受体β基因的核苷酸序列为序列1第7-1599位；或所述抗性筛选基因表达盒的抗性筛选基因为卡那霉素抗性基因；或所述抗性筛选基因表达盒的核苷酸序列为序列4第540‐1853位；或所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒的报告基因为GFP基因，所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒的核苷酸序列为序列4第1815‐3242位；或所述表达载体为p426GDP载体或p416GDP载体；或所述同源重组片段的核苷酸序列为序列4第33‐3748位；或所述同源重组片段通过整合质粒介导的同源重组整合；或所述整合质粒的核苷酸序列为序列4；或所述酵母为酿酒酵母。本专利技术另一个目的是提供一种构建重组菌的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：将雌激素受体β基因和含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒导入所述酵母，得到重组菌。上述方法中，所述方法还包括将抗性筛选基因表达盒导入所述酵母；或，所述雌激素受体β基因以重组载体的方式导入所述酵母中进行表达；或，所述抗性筛选基因表达盒和所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒通过同源重组片段整合到所述酵母基因组中进行表达；所述同源重组片段包括抗性筛选基因表达盒和所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒。上述方法中，所述重组载体为将所述雌激素受体β基因插入表达载体中，且表达所述雌激素受体β基因的载体；所述重组载体中，驱动所述雌激素受体β基因表达的启动子为序列表中序列2或序列4所示的DNA分子；或所述整合均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；或所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；或所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。上述方法中，所述雌激素受体β基因的核苷酸序列为序列1第7-1599位；或所述抗性筛选基因表达盒的抗性筛选基因为卡那霉素抗性基因；或所述抗性筛选基因表达盒的核苷酸序列为序列4第540‐1853位；或所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒的报告基因为GFP基因，所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒的核苷酸序列为序列4第1815‐3242位；或所述表达载体为p426GDP载体或p416GDP载体；或所述同源重组片段的核苷酸序列为序列4第33‐3748位；或所述同源重组片段通过整合质粒介导的同源重组整合；或所述整合质粒的核苷酸序列为序列4；或所述酵母为酿酒酵母。上述重组菌在检测雌激素化合物中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述重组菌在制备检测雌激素化合物产品中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术第三个目的是提供检测雌激素化合物产品。本专利技术的产品，包括上述重组菌。上述酿酒酵母为BY4742。上述雌激素化合物为17‐β雌二醇、17‐a雌二醇或4‐羟基雌二醇。本专利技术利用合成生物学和代谢工程手段将抗性基因表达盒、3个串联的ERE和启动子为ADH的GFP基因表达盒整合到酵母宿主染色体中，然后再转入含有雌激素受体表达载体，获得重组酵母。结果显示，重组酵母在雌激素类化合物存在时，可稳定高效合成GFP，GFP的表达量与雌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组菌，为在酵母中表达雌激素受体β基因和含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒，得到的重组菌；所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒依次包括所述3个串联ERE基因、驱动报告基因表达的启动子和所述报告基因。

【技术特征摘要】
1.一种重组菌，为在酵母中表达雌激素受体β基因和含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒，得到的重组菌；所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒依次包括所述3个串联ERE基因、驱动报告基因表达的启动子和所述报告基因。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌中还表达抗性基因表达盒；或所述3个串联ERE基因的核苷酸为序列表中序列4第1815‐1853位；或，所述驱动报告基因表达的启动子为部分ADH1；所述部分ADH1的核苷酸序列为序列4第1860‐2269位。3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述在酵母中表达雌激素受体β基因为将所述雌激素受体β基因以重组载体的方式导入所述酵母中进行表达；或，所述在酵母中表达雌激素受体β基因、抗性筛选基因表达盒和含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒为将同源重组片段整合到所述酵母基因组中进行表达；所述同源重组片段包括所述抗性筛选基因表达盒和所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒的片段。4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述重组载体为将所述雌激素受体β基因插入表达载体中，且表达所述雌激素受体β基因的载体；所述重组载体中，驱动所述雌激素受体β基因表达的启动子为序列表中序列2或序列4所示的DNA分子；或所述整合均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；或所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；或所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或整合质粒介导的同源重组。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述雌激素受体β基因的核苷酸序列为序列1第7-1599位；或所述抗性筛选基因表达盒的抗性筛选基因为卡那霉素抗性基因；或所述抗性筛选基因表达盒的核苷酸序列为序列4第540‐1853位；或所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒的报告基因为GFP基因，所述含有3个串联ERE基因的报告基因表达盒的核苷酸序列为序列4第1815‐3242位；或所述表达载体为p426GDP载体或p416GDP载体；或所述同源重组片段的核苷酸序列为序列4第33‐3748位；或所述同源重组片...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海胜，赵百锁，仝继旭，
申请(专利权)人：中国农业科学院研究生院，
类型：发明
国别省市：北京,11