人α防御素5在酿酒酵母中分泌表达的方法技术

一种人α防御素5在酿酒酵母中分泌表达的方法，是利用分泌型酿酒酵母表达载体构建含有人α防御素5基因的重组酿酒酵母表达载体，将构建的重组酿酒酵母表达载体导入酿酒酵母中，获得重组酿酒酵母，培养重组酿酒酵母使人α防御素5基因得到表达。本发明专利技术使用天然存在质粒的酿酒酵母作为表达体系，通过分泌表达，目的蛋白多肽直接存在于发酵液的上清液中，不仅能保证表达的目的蛋白具有正确的天然构象；而且产物存在于上清中，不必破碎细胞，大大简化了分离纯化的工序，降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种人α防御素5的表达方法，特别是指一种在酿酒酵母菌表达系统中表达人α防御素5的方法。
技术介绍
防御素是生物体内产生的一类抗菌多肽活性物质，可对抗外源性病原体，是抗菌肽家庭中最大的亚家族，是生物体先天免疫的重要组成部分，与补体、干扰素等组成了宿主重要的初级免疫防御系统。类似于一般的防腐剂，天然防御素可通过物理作用造成细胞膜穿孔而达到广谱高效的抗菌效果，且安全无残留。与普通的抗生素相比，防御素具有一定的优越性：一、防御素分子来源于活体生物，能很好地进入微生物细胞内，导致膜通透性增加进而破坏其能量代谢系统，最终实现快速抑制微生物的活动、生长和繁殖。二、防御素独特的抑菌机制使病原微生物不易产生耐药性突变，更安全可靠。三、防御素表现出与抗生素典型的协同作用，例如：调节机体免疫应答和炎症反应，中和内毒素，调节组织创伤修复等。近几年来，潘氏细胞(Paneth cell，PC)分泌的人α防御素5(HD-5)在肠粘膜中抵御微生物的作用受到广泛关注；HD-5因抗菌谱广、不影响肠道微生态平衡、不易产生耐药等优点，为开发新型抗肠源性感染药物迎来了曙光。DEFA5的位置在第8条染色体的p21-pter区，有两个外显子，一个内含子将两个外显子隔开。DEFA5基因大小为449bp，其中前40bp为5'端非翻译区(5'-UTR)，41～97bp为基因的信号肽序列，227～322bp才是编码HD-5成熟肽的碱基序列，r>而信号肽和成熟肽之间的序列为前片段，433～438则是PolyA序列。HD-5前体蛋白有94个氨基酸，包括信号肽序列和前区序列和α-防御素5成熟肽。人HD-5成熟肽(mature human alpha-defensin-5，mHD-5)包含32个氨基酸，相对分子质量为3.58kD的阳离子短肽；具有保守性的6个半胱氨酸残基分别构成了3个分子内二硫键(Cys65-Cys93、Cys72-Cys92、Cys67-Cys82)。经进一步的活性检测，人HD-5不但可以高效杀灭各种细菌，而且具有较强的抗病毒生物活性。数据分析表明人HD-5很可能是人α防御素中抑菌活性最强的，对革兰氏阴性(G-)菌、革兰氏阳性(G+)菌、螺旋体、真菌、原生动物以及有包膜病毒等都有明显的抑/杀作用。人HD-5还表现出刺激小肠分泌、抑制NK细胞活性、促进炎性细胞趋化等功能，并且在抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染人宫颈癌细胞(HeLa)的研究中具有较好的生物活性，因此人HD-5被认为是病毒性性病防治和肠源性与生殖道细菌感染的候选新型药物分子，在临床上具有良好的开发应用前景。但是，人α-防御素5一般是通过从特定组织中提取或者是通过化学合成多肽的方法获得。因此，如何高效地表达人α防御素5成为努力的方向。酵母作为工程受体菌近年来发展迅速，相对于大肠杆菌而言，酵母具有更完善的基因表达调控机制和翻译后加工修饰能力和分泌能力，且不产生内毒素，是良好的真核基因受体菌。酵母具有基因操作相对简单，外源蛋白加工与修饰正确、表达量高、易于纯化、适于大量发酵培养等优点。且根据原核生物蛋白进行产物特异性设计，靶DNA与真核基因调控基因无同源性，因此不存在基因的非特异性影响，能够严格调控基因的表达，而人为地调控基因的表达情况以高效的诱导基因表达也是其他系统所不及之处。巴斯德毕赤酵母是常用的重组蛋白表达的宿主菌之一。用于转化毕赤酵母的重组质粒为穿梭质粒，含有大肠杆菌的复制起始点，但是这类质粒无法在毕赤酵母中复制并稳定存在，只有将重组表达载体整合入毕赤酵母基因中后才能稳定存在。因此，对于外源基因的转入、内源蛋白酶活性、宿主菌的种类和状态等因素都能影响外源蛋白在毕赤酵母中的表达效率。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种可高效表达人α防御素5基因的人α防御素5在酿酒酵母中分泌表达的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种人α防御素5在酿酒酵母中分泌表达的方法，该方法是利用分泌型酿酒酵母表达载体构建含有人α防御素5基因的重组酿酒酵母表达载体，将构建的重组酿酒酵母表达载体导入酿酒酵母中，获得重组酿酒酵母，培养重组酿酒酵母使人α防御素5基因得到表达。所述分泌型酿酒酵母表达载体为pVT102U-α质粒。构建的重组酿酒酵母表达载体为pVT102-α-HD5。本专利技术中将构建的重组酿酒酵母表达载体导入酿酒酵母中的方法为电击转化法，当然也可采用生物领域中的其它常用方法。本专利技术使用天然存在质粒的酿酒酵母作为表达体系进行相关实验。相对于毕赤酵母，酿酒酵母拥有与其相似的分子及遗传操作优点，但是外源基因不整合入宿主DNA，对宿主细胞不产生本质上的影响，细胞自身不对外源蛋白表达效率产生影响。且本专利技术为分泌表达，目的蛋白多肽直接存在于发酵液的上清中，一方面，这种表达方式能保证表达的目的蛋白具有正确的天然构象；另一方面，产物存在于上清中，不必破碎细胞，大大简化了分离纯化的工序，降低生产成本。再者，酿酒酵母为安全菌株，其表达产物易于达到各类应用所需的安全要求，可广泛应用于食品、医药、动物营养及美容保健等领域。附图说明图1是琼脂糖凝胶电泳检测搭桥PCR的扩增结果图。其中，1：20bp DNA Ladder Marker；2、3：搭桥PCR扩增最终产物。图2是分泌型酿酒酵母表达载体pVT102U-α质粒图谱。图3是菌落PCR筛选重组质粒pVT102U-α-HD5的电泳检测图。其中，1：Trans2K plus DNA Marker；2、3：重组质粒阳性克隆菌落PCR产物。图4是HD-5对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图。其中，1和2表示100μL 0.02mg/mL的氨苄青霉素(Amp)；3和4表示100μL重组酵母S78/pVT102U-α-HD5的发酵液上清液。图5是HD-5对大肠杆菌的抑菌效果图。其中，1和2表示100μL 0.02mg/mL的氨苄青霉素(Amp)；3和4表示100μL重组酵母S78/pVT102U-α-HD5的发酵液上清液。具体实施方式实施例1、防御素基因的克隆和表达载体的构建1、NCBI上找到HD5的蛋白序列，参照大酿酒酵母菌的密码子偏好，设计其可编码的DNA序列。2、设计搭桥引物，并在序列的5’端和3’端引入酶切位点与相应的保护碱基。搭桥内侧引物：上游引物HD5-F1：5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人α防御素5在酿酒酵母中分泌表达的方法，其特征在于，该方法是利用分泌型酿酒酵母表达载体构建含有人α防御素5基因的重组酿酒酵母表达载体，将构建的重组酿酒酵母表达载体导入酿酒酵母中，获得重组酿酒酵母，培养重组酿酒酵母使人α防御素5基因得到表达。

【技术特征摘要】
2015.01.27 CN 201510040506X1.一种人α防御素5在酿酒酵母中分泌表达的方法，其特征在于，该方
法是利用分泌型酿酒酵母表达载体构建含有人α防御素5基因的重组酿酒酵母
表达载体，将构建的重组酿酒酵母表达载体导入酿酒酵母中，获得重组酿酒酵
母，培养重组酿酒酵母使人α防御素5基因得到表达。
2.如权利要求1所述的人α防御素5在...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈金军，许琪瑶，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43