被工程化为过表达辅助蛋白的重组宿主细胞制造技术

本发明专利技术属于重组生物技术领域，特别属于蛋白质表达领域。本发明专利技术一般涉及一种从宿主细胞中表达目标蛋白(POI)的方法。本发明专利技术特别涉及改善宿主细胞表达和/或分泌目标蛋白的能力，和宿主细胞在蛋白质表达中的用途。本发明专利技术还涉及细胞培养技术，更具体地涉及培养细胞以生产用于医学目的或食品的所需分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】被工程化为过表达辅助蛋白的重组宿主细胞
本专利技术属于重组生物
，特别属于蛋白质表达领域。本专利技术一般涉及一种从宿主细胞中表达目标蛋白(POI)的方法。本专利技术特别涉及改善宿主细胞表达和/或分泌目标蛋白的能力，和宿主细胞在蛋白质表达中的用途。本专利技术还涉及细胞培养技术，更具体地涉及培养细胞以生产用于医学目的或食品的所需分子。
技术介绍
已经采用原核和真核宿主完成了目标蛋白(POI)的成功生产。最突出的实例是如大肠杆菌(Escherichiacoli)的细菌，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或多形汉森酵母(Hansenulapolymorpha)的酵母菌，如泡盛曲霉(Aspergillusawamori)或里氏木霉(Trichodermareesei)的丝状真菌，或如CHO细胞的哺乳动物细胞。虽然一些蛋白质的产量容易以高效率实现，但是很多其它蛋白质仅以相对低的水平生产。为了提高重组蛋白的分泌，一种策略是针对涉及蛋白质折叠和加工的宿主分泌途径。在WO93/25676中首次建议将编码蛋白质二硫键异构酶(PDI)的cDNA和编码异源二硫键键合蛋白质的cDNA的共表达作为增加异源蛋白产量的方法。WO93/25676报道了通过与PDI共表达可以提高安逖斯塔辛(antistasin)和蜱抗凝血蛋白的重组表达。WO94/08012提供了通过增加Hsp70伴侣蛋白(即KAR2/BiP，或PDI伴侣蛋白质)的表达来提高酵母菌中过表达的蛋白质的分泌的方法。WO05/0617818和WO06/067511提供了通过采用基于2μm的表达质粒在酵母菌中生产所需的异源蛋白的方法。已证明，当一个或多个伴侣蛋白与异源蛋白的基因在同一质粒上共表达时，异源蛋白的产量显著提高。WO2008/128701A2描述了通过利用蛋白质BMH2、BFR2、COG6、COY1、CUP5、IMH1、KIN2、SEC31、SSA4和SSE1中的一个来增加POI从真核细胞中的分泌的表达系统。另一种增加蛋白质生产的方法基于激活未折叠蛋白反应(UPR)的转录因子HAC1的过表达。转录分析表明超过330个基因受HAC1的调控，这些基因中的多数涉及分泌细胞器的分泌或生物发生(biogenesis)。WO01/72783描述了通过诱导升高的未折叠蛋白反应(UPR)来增加从真核细胞中分泌的异源蛋白质的量的方法，其中所述UPR受选自HAC1、PTC2和IRE1的蛋白质的共表达的调节。Wentz等利用酿酒酵母的酵母菌表面展示基因文库，以通过应用合适的选择压力来鉴定分泌改善的菌株。发现酵母菌cDNACCW12、SED1、CWP2、RPP0以温度依赖的方式增强scTCR展示。当在20℃下诱导时，ERO1增强蛋白分泌(Wentz等，Appl.Environ.Microbiol.(2007)73(4):1189-1198)。Liu等(Biotechnol.Prog.(2006),22:1090-1095)证明在巴斯德毕赤酵母中Kar2的共过表达使rhG-CSF表达增加了5.6倍。将KAR2与Sec63、PDI1和YDJ1组合实现了2.8倍、6.5倍和5.94倍的增加。在Blatt等实施的实验中，KAR2(BiP)的共过表达使A33scFv在毕赤酵母中的表达增加了两倍。将KAR2与PDI1组合几乎消除了积极KAR2作用(Blatt等，Appl.Microbiol.Biotechnol.,2007,74:381-389)。Guerfall等探讨了在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris.)中过表达内源性HAC1的作用。此外，HAC1被组成型地和诱导型地过表达。在所有的例子中，证实了诱导的UPR的结果是增加的KAR2表达。全长HAC1的组成型过表达有很小或没有作用，而在四分之一的例子中，HAC1的诱导形式的过表达导致了蛋白质分泌的增加，在四分之三的例子中，HAC1的诱导形式的过表达导致了蛋白质分泌的降低(Guerfall等，MicrobialCellFactories,(2010),9:49)。Sleep等证明LHS1的共过表达增加了rHA的浓度。LHS1与SIL1、JEM1和SCJ1组合，但效价(titer)低于单独与Jem1共过表达。在相同的时间，SIL1、LHS1和JEM1的共过表达使GM-CSF表达提高了1.45倍，而使rHA表达提高了近1.1和2倍，这取决于培养基(Sleep等，AppliedandEnvironmentalMicrobiology,(2008)74(24):7759-7766)。US2009221030A1描述了多种辅助蛋白(特别是BiP1)单独地和与其它辅助蛋白(特别是LHS1)组合在里氏木霉中的共表达。单独BiP1获得了最高表达值，而BiP1与LHS1的组合导致了分泌的蛋白效价降低8％。US8,440,456提供了巴斯德毕赤酵母的基因组序列，并公开了编码单一肽、分子伴侣和启动子的核酸序列。其公开了包含核酸序列的表达载体和能够过表达14种分子伴侣的遗传工程化的酵母菌。具体选择ROT1、SHR3和SIL1来试验，然而，SIL1未观察到表达，且ROT1或SHR3的过表达未能引起异源蛋白质分泌的任何显著增强。在宿主细胞中高水平的蛋白产量可被一个或多个不同步骤，如折叠、二硫键的形成、糖基化、在细胞内转运或自细胞中释放限制。基于目前本领域最先进的知识，甚至当宿主生物体的全部基因组的DNA序列可获得时，许多涉及的机制仍然不能被完全理解且不能预测。仍然需要改善宿主细胞生产和/或分泌目标蛋白的能力的方法。本专利技术的一个目的是提供提高重组蛋白质在宿主细胞中的产量的新方法，所述方法是简单且有效的并适用于工业方法。本专利技术的另一目的是提供实现上述目的的宿主细胞。又一目的是识别可用于提供所述宿主细胞的新的辅助蛋白及编码该辅助蛋白的序列。必须指出的是，除非上下文另有明确指示，本文所用单数形式“一(a)”、“一种(an)”和“所述/该(the)”包括所提及的复数且反之亦然。因此，例如，提及的“一种宿主细胞”或“一种方法”分别包括一种或多种所述宿主细胞或方法，并且提及的“所述方法”包括本领域普通技术人员已知的可被修饰或置换的等效步骤和方法。类似地，例如，提及的“方法(methods)”或“宿主细胞(hostcells)”分别包括“一种宿主细胞”或“一种方法”。除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”将被理解为是指该系列中的每一元素。本领域技术人员将承认或采用常规实验能够确定，本文所述的本专利技术的具体实施方案的许多等价方案。这种等价方案意图被本专利技术所涵盖。术语“和/或”无论在本文何处使用均包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的全部或任意其它组合”的含义。例如，A、B和/或C的含义是A、B、C，A+B、A+C、B+C和A+B+C。本文所用术语“约(about)”或“大约(approximately)”的含义是在给定值或范围的20％内，优选地10％内，和更优选地5％内。其还包括具体数目，如，约20包括20。术语“少于”、“多于”或“大于”包括具体数目。例如，少于20的含义是≤20，多于20的含义是≥20。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQ ID NO:4、1、2、3、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQ ID NO:4、1、2、3、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.17 EP 14165186.91.一种用于制备目标蛋白的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQIDNO:4、1、2、3、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白，其中所述功能同系物与示于SEQIDNO:4、1、2、3、5、6、7、8、9或162的氨基酸序列具有至少30％的序列同一性。2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中与工程化之前的宿主细胞相比，所述辅助蛋白或所述其功能同系物使模型蛋白SDZ-Fab(SEQIDNO:25和26)和/或HyHEL-Fab(SEQIDNO:29和30)的产量增加。3.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其中所述多核苷酸整合在所述宿主细胞的基因组中或包含在载体或质粒中。4.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其中所述多核苷酸的过表达通过(i)采用驱动所述多核苷酸表达的重组启动子或(ii)修饰可操作地连接至所述多核苷酸的调控序列实现。5.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母、多形汉森酵母、里氏木霉、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、解脂耶氏酵母、甲醇毕赤酵母、博伊丁假丝酵母和Komagataella，和粟酒裂殖酵母。6.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其中2、3、4、5、6、7、8或更多个选自SEQIDNO:4、1、2、3、5、6、7、8、9或162或其功能同系物的辅助蛋白过表达。7.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为低表达至少一种多核苷酸，所述多核苷酸编码蛋白质，所述蛋白质具有与示于SEQIDNO:10、11和/或12的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性的氨基酸。8.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其包含编码所述目标蛋白的异源多核苷酸序列。9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述目标蛋白为酶、治疗性蛋白、食品添加剂或饲料添加剂、或抗体或抗体片段。10.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞被工程化为：(i)过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQIDNO:4的氨基酸序列或其功能同系物和示于SEQIDNO:2的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白；(ii)过表达多核苷酸，所述多核苷酸编码具有示于SEQIDNO:162的氨基酸序列或其功能同系物和示于SEQIDNO:2的氨基酸序列或其功能同系物的辅助蛋白；(iii)过表达多核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·加瑟，D·玛塔诺维克，M·布凯泰克斯，
申请(专利权)人：贝林格尔·英格海姆RCV两合公司，山德士股份公司，VTU技术股份有限公司，隆萨有限公司，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT