提供通过将表达的蛋白靶向宿主细胞包膜从导入原核宿主细胞中的重组ＤＮＡ产生膜蛋白或毒蛋白的方法和组合物。所述方法和组合物使用融合至感兴趣蛋白的蛋白运载体。所述融合蛋白可以含有一个或更多个蛋白酶切割位点以体内或体外从所述蛋白运载体分离所述感兴趣的蛋白。所述蛋白运载体的特征是被包含细胞质亲和结合结构域的细胞质氨基酸序列分隔的膜靶向肽和跨膜区段。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】将感兴趣蛋白靶向宿主细胞包膜的方法和组合物
技术介绍
已经尝试在细菌中表达重组真核膜蛋白，但这些方法因包括毒性和不溶性的原因 以及内含体不期望的形成而存在问题(Grisshammer等Biochem. J. 295 :571_576 (1993)； Tucker 禾口 Grisshammer Biochem. J. 317 891-899 (1996) ；Weiss 禾口 GrisshammerEur. J.Biochem. 269 :82-92(2002) ；Yeliseev 等 Protein Sci. 14 :2638_53(2005) ；Krepkiy 等 Protein Expr Purif.49 60-70(2006) ；Yeliseev 等 Protein Expr Purif. 53 153-163(2007))。另外，缺乏在大肠杆菌(E. coli)中重组膜蛋白过表达的可靠的方法。真核膜蛋白通过在N末端信号序列或C末端靶向序列中编码的地址而靶向真核细 胞中各区室(Emanuelsson 等 Nature Protocols 2:953-971 (2007))。在生物发生过程中 通常除去信号序列。在没有膜区室化的细菌中，大部分新翻译的膜蛋白——即使与核糖体相结合 时——被信号识别颗粒(SRP)和SRP受体蛋白识别，以靶向至围绕细菌细胞的内膜。在 大肠杆菌中研究的大部分内膜蛋白使用SRP通路和Sec移位酶来靶向至膜和膜装配。 另外，膜蛋白的亚型对YidC具有绝对要求，YidC为辅助膜插入过程的大肠杆菌的多 起源内膜蛋白。YidC对于大肠杆菌细胞生存力是必需的(Samuelson等Nature 406 637-641 (2000) ；Urbanus 等EMB0 Rep. 2 524-529 (2001) ；van Bloois 等 J. Biol. Chem. 280 12996-13003(2005))。蛋白——其依赖二硫键获得其天然结构——的稳定表达的选择方法是将新合成 的蛋白输出到含有二硫键催化酶(SRP-依赖性DsbA、DsbB、DsbC和DsbD)的大肠杆菌周质 中(Bardwell 等Cell 67 581(1991);叙111行&111等￡]\ 0 J. 11 57(1992) ；Novagen (now EMD Chemicals,Inc. ,Gibbstown,NJ)pET system manual (llthed. Jan. 2007) ；Missiakas 等 EMB0 J. 13 2013-2020 (1994)；以及 Zapun 等 Biochemistry34 :5075_5089 (1995))。输出到周质的候选蛋白可以使用信号肽搜索算法如Phobius(http://phobius. sbc. su. se/) (Kail 等，Nucleic Acids Res. 35 :W429_32 (2007))禾口 Signal P (http: //www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/) (Emanuelsson 等 Nat Protoc. 2 (4) :953_71 (2007))通过 N末端信号肽来鉴定。然而，向周质输出受到Sec蛋白输出机器流通容量的限制(P6reZ-P6reZ等 Biotechnology 12(2) 178-80 (1994))，其中Sec转移酶可以变饱和并且导致天然分 泌蛋白的细胞质积聚和过表达感兴趣的蛋白(Wagner等Mo 1. Cell Proteomics6 (9) 1527-50(2007))。当感兴趣的蛋白对于大肠杆菌是非天然的和/或不是正常分泌的时，这 更普遍地被观察到。可选地，非天然蛋白可以在合成期间变得错误折叠，从而变得不适于 Sec-介导的跨内膜输出。专利技术概述本专利技术的实施方式提供导入具有细胞质区室(cytoplasmic compartment)和包膜 的原核宿主细胞中的重组DNA。该重组DNA编码N末端蛋白运载体，所述N末端蛋白运载体 将融合到该运载体的感兴趣的蛋白从细胞质区室运输到包膜，其中编码的蛋白运载体包括膜靶向肽、细胞质亲和结合结构域和跨膜区段。编码蛋白运载体的DNA优选与编码感兴趣 蛋白的DNA融合。在一个实施方式中，编码的膜靶向肽特征是对于21的窗口大小至少1.52的 Goldman-Engelman-Steitz (GES)疏水性分数。在另外的实施方式中，编码的膜靶向肽和编 码的跨膜区段——它们可以彼此不同——然而具有21个氨基酸的氨基酸窗口，以便在21 个氨基酸窗口内存在缺少Asp、Glu、Arg和Lys的至少9个氨基酸的疏水核心序列。在另外 的实施方式中，膜靶向肽是YidC依赖性的。YidC依赖性肽的实例是PVIII、Pf3外壳和亚基 C变体L31F。在另外的实施方式中，跨膜区段的21个氨基酸窗口在N末端侧翼是这样的氨 基酸序列，所述氨基序列包含总电荷为至少+1的至少9个氨基酸。另外，跨膜区段在C末 端侧翼可以是氨基酸连接序列，其可以含有信号肽酶切割位点。氨基酸连接序列可以 含有 异源蛋白酶切割位点。编码的跨膜区段可以是信号肽酶的TM2。在本专利技术的实施方式中，细胞质亲和结合结构域是糖结合结构域，例如壳多 糖_结合结构域或His标记和str印标记。在本专利技术的实施方式中，提供包含膜靶向肽、细胞质亲和结合结构域和跨膜区段 的融合蛋白。融合蛋白可以另外包含感兴趣的蛋白。例如，感兴趣的蛋白可以是膜蛋白或 毒蛋白，如重组限制性内切核酸酶，如Sau3AI或其同切点酶。在本专利技术的实施方式中，提供在革兰氏阴性菌宿主细胞中产生重组蛋白的方法， 该方法包括获得编码蛋白运载体的重组DNA，所述蛋白运载体特征如上并且融合到编码感 兴趣蛋白的DNA，以及用该DNA转化宿主细胞。重组蛋白可以通过将细胞质亲和结合结构 域结合到亲和性底物(基底)从宿主细胞纯化。亲和性底物可以用于检测、纯化和/或测 定表达的感兴趣蛋白的量。也可以测定表达的感兴趣蛋白的酶活性。感兴趣的蛋白实例包 括Sau3AI和BfuCI。在感兴趣的蛋白含有半胱氨酸而不需要二硫桥的情况下，宿主细胞因 dsbA基因中突变而优选具有DsbA—表型。在本专利技术的实施方式中，提供包含SEQ ID NO 23的核苷酸序列631-1986的DNA。在本专利技术的实施方式中，提供在上面所述Sau3AI或其同切点酶的同源甲基化 (cognate methylation)不存在的情况下产生限制性内切核酸酶的方法。另外提供包含上 述重组DNA的载体。也提供用载体转化的宿主细胞。附图简述图1显示PhoAl位于细胞质中的pVIII-PhoAl融合蛋白的膜拓扑结构。图2显示pVIII-TM2的膜拓扑结构，其中感兴趣的蛋白被输出到周质。(“TM2”是 任何跨膜区段的缩写。)图3显示pVIII-8His的膜拓扑结构，其中感兴趣的蛋白位于pVIII和融合连接 (fution junction)之间。图4显示证明各种膜靶向肽表达的抗pVIII免疫印迹。pVIII-P2是对照融合蛋 白，其表达自亲代表达克隆PVIII-P2。( “P2”是感兴趣本文档来自技高网...
【技术保护点】
组合物，其包含：编码Ｎ末端蛋白运载体的重组ＤＮＡ，所述Ｎ末端蛋白运载体用于将融合到所述运载体的感兴趣蛋白从细胞质区室运输到原核细胞包膜；编码的蛋白运载体，其包含： 膜靶向肽、细胞质亲和结合结构域和跨膜区段； 编码蛋白运载体的ＤＮＡ，其被融合到编码感兴趣蛋白的ＤＮＡ。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：JC塞缪尔森，J罗，
申请(专利权)人：新英格兰生物实验室公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。