本发明专利技术描述了包括用于增加重组蛋白表达水平的重组表达载体元件（ｒＥＶＥ）的组合物和方法。本发明专利技术还描述了用于减少、显著抑制或基本上沉默重组蛋白表达的其它组合物和方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于增加宿主细胞中重组蛋白表达的重组表达载体元件(REVES)相关申请的交叉参考 本申请要求于2007年3月30日提交的美国临时申请第60/921,141 号的优先权。专利技术背景使用核酸载体分子用于在不同和广泛种类的真核或原核宿主细胞 内表达重组蛋白的多种系统是可利用的。使用何种载体/宿主细胞对的 决定通常视何种系统提供呈最优选适于其所欲用途的形式的所要重组 基因产物的最高产率而定。例如，如果诸如糖基化作用的翻译后修饰 对所要重组蛋白的需要(例如，就抗原性、活性、构象等等而言)是关键 的，则真核宿主细胞系统将是所期望的，因为原核细胞在特征上缺乏 翻译后糖基化活性。还重要的为，载体/宿主细胞对不仅产生呈所希望 形式的表达基因产物，而且所希望表达基因产物的分子可易于从产生 其的细胞分离。由于涉及开发欲用于人类疗法的重组蛋白的成本逐步升高，仍需 不断努力以增加该重组蛋白的表达水平，尤其在使用真核宿主细胞的 系统中的表达水平。已表征各种顺式和反式作用调节元件，其具有可 改善所要重组基因产物的表达效率和/或总产率的核苷酸序列(DNA或 RNA)。这样的调节元件包括但不限于高度有效启动子、转录增强子序 歹寸(参见，例如，Dillon和Grosveld的评论，7>e"A Ge"". ， 9: 134 (1993))、 基因座控制区(LCR;参见，例如，Grosveld等人，Ce〃, 5/: 975 (1987))、 基质或支架附着区(MAR、 SAR;参见，例如，美国专利第7,129,062 号；Bode等人，/"f. i ev. Q^ /., /6Z4: 389-454 (1995); Bode等人， CWf. Aev.五wto，"'c G匿Ex戸肌》w, 6: 115-138 (1996)); P鬲离子元件 (参见，例如，Kellum等人，Ce〃， " 941 (1991);和内部核糖体进入 位点(IRES;参见，例如，McBratney等人的评论，Cw". (9p/". Ce〃说o/., 5: 961 (1993))。随后发现这样的元件的一些核酸序列拥有可影响表达 的特定子序列。尽管对于在可影响重组蛋白在各种类型的宿主细胞内的表达的各 种序列及其它因素的了解有进展，但仍需要改善重组蛋白的产率，尤 其在当这样的重组蛋白欲用于治疗或其它特殊应用时。专利技术概述本专利技术提供了分离的核酸分子(多核苷酸分子)，其包含增加重组蛋 白的表达的核苷酸碱基序列。这样的核酸分子在本文中称为重组表达载体元件(rEVE)。与不存在rEVE的表达水平相比，rEVE在表达载体 上的存在增加一种或多种重组蛋白的表达水平，所述重组蛋白是由一 个或多个驻留在表达载体上的功能基因来编码。无论rEVE位于编码所 关注重组蛋白的基因的5'、 3'还是5'和3'(例如旁侧)，重组蛋白的表达 水平的该rEVE介导的增加均是可能的。无论编码在单独相应基因上还 是编码在表达载体上存在的单一多顺反子基因上，表达载体上存在的 rEVE可增加一种或多种重组蛋白的表达。REVE可用于使用稳定表达 系统和瞬时表达系统来增加重组蛋白的表达水平。在一个实施方案中，本专利技术提供了分离的rEVE多核苷酸分子，其 包含选自下列的核苷酸碱基序列SEQ ID NO: l("ARMl")的碱基序列、 SEQ ID NO: 2 ("ARM2")的碱基序列和前述序列的任一个的增加表达 部分，其中当rEVE多核苷酸作为编码所关注重组蛋白的重組基因存在 于相同表达载体上时，重组蛋白的表达水平与不存在rEVE的表达水平 相比是增加的。本专利技术的优选rEVE分子包括2329碱基对(bp)的rEVE核酸分子， 其具有SEQ ID NO: 1的核苷酸碱基序列；和2422 bp的rEVE核酸分 子，其具有SEQIDNO: 2的核苷酸碱基序列。SEQ ID NO: 2的序列的3'末端区含有对于rEVE介导的蛋白表达 增加而言是关键的序列。这样的优选的SEQ ID NO: 2的3'末端区序列 包括SEQ ID NO: 2的碱基462-2422的序列和SEQ ID NO: 2的碱基 1087-2422的序列。包含本文中所述的一个或多个核苷酸碱基序列的分离的rEVE核 酸分子可具有多种形式中的任一个，包括但不限于直链核酸分子、质 粒、真核病毒分子、原核病毒(噬菌体)分子、人工染色体和重组染色体。在一个优选实施方案中，本专利技术提供了包含至少一种本文中所述rEVE的表达载体。与在携带缺乏rEVE的相同表达载体的宿主细胞中 的表达水平相比，该含rEVE的表达载体在适当宿主细胞中提供了至少 一个编码在表达载体上的重组蛋白的增加(提高)的表达水平。适用于本 专利技术的表达载体包括任何核酸载体分子，其可经工程化以在适当(同源) 宿主细胞中编码和表达一种或多种重组蛋白。这样的表达载体包括但 不限于真核质粒载体、真核病毒载体、原核质粒、噬菌体载体、穿梭 载体(例如可在真核和原核细胞中复制的载体)、微型染色体 (mini画chromosome)和各种人工染色体。优选i也,表达载体为质粒表达 载体，更优选为稳定整合到真核宿主细胞基因组中的质粒表达载体， 且甚至更优选为通过非同源重组而稳定整合到宿主细胞基因组中的质 粒表达载体。在另一个实施方案中，本专利技术提供了宿主细胞，其含有包含本文 中所述的rEVE和指导至少一种重组蛋白在宿主细胞内表达的重组基 因的表达载体。宿主细胞可为真核或原核宿主细胞。适用于本专利技术的 优选真核宿主细胞包括但不限于哺乳动物宿主细胞、植物宿主细胞、 真菌宿主细胞、真核藻类宿主细胞、原生动物宿主细胞、昆虫宿主细 胞和鱼类宿主细胞。更优选地，适用于本专利技术的宿主细胞为哺乳动物 宿主细胞，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Vero 细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人类胚肾(HEK 293)细胞、幼仓 鼠肾(BHK)细胞、Hela细胞、人类B细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、 3T3细胞、HEPG2细胞、PerC6细胞和MDCK细胞。特别优选的为CHO 细胞，其可用标准曱氨喋呤处理方案处理以扩增插入宿主细胞中的表 达载体上的重组基因的拷贝数量。可在本专利技术中用作宿主细胞的真菌 细胞包括但不限于子嚢菌(Ascomycete)细胞，诸如曲霉属(/^; ^g/〃z^)、 链孢霉属(AAewravora)，和酵母细胞，尤其为选自下列的属的酵母酵 母菌属(Sacc/zaramyce力、毕赤酵母属(尸/c/z,a)、汉森酵母属(Z/aw"w"/a)、 裂殖酵母属(Sc/z/zc^(2cc/zar函;vc—、 克鲁维酵母属(^7t(yvera考ces)、 耶 氏酵母属(K^raM^)和念珠菌属(Omt/z^)。可根据本专利技术用作用于表达 重组蛋白的宿主细胞的优选酵母物种包括但不限于酿酒酵母 (Sacc/zaromyces 、 多形汉森酵母(//0"化""/(3/70(ym077 /2a)、 乳酸克鲁维酵母(^7t(yveraw少c^ /"cto)、曱醇酵母(尸/c/z/a / a^or&)、粟酒 裂歹直酵母(Sc/n'zos73cc/z"romyces / ow6e)禾口耶罗纟,亚解月旨酵母本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的重组表达载体元件（ｒＥＶＥ）多核苷酸分子，其包含选自下列的核苷酸碱基序列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的核苷酸碱基序列、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２的核苷酸碱基序列、与任何前述序列互补的序列、任何前述序列的增加表达部分及其组合。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：WR焦恩，GR卡森，H高，YZ库尼斯，
申请(专利权)人：艾博特公司，
类型：发明
国别省市：US[]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。