本发明专利技术提供了在真核宿主中整合治疗性蛋白和抗体的产生和/或筛选、演化和表达的方法，以实现在单一系统中生产。在同一真核宿主系统中产生、优化并生产治疗性蛋白，包括抗体。本发明专利技术公开的综合性整合的抗体优化系统(CIAO！TM)可同时实现蛋白性能和表达优化的演化。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
在ー个具体方面，本专利技术涉及蛋白和通过蛋白演化优化蛋白。使用相同的遗传系统，在同一宿主中发现、演化和生产治疗性蛋白药物。
技术介绍
已设计、开发和实施了能产生候选治疗性蛋白分子的多种抗体和其它蛋白系统。最近，已开发出多种演化系统以改善蛋白的功能。另外，已开发出用于高产量生产治疗用抗体和其它蛋白的哺乳动物表达系统。迄今为止，还没有研究组开发出一种系统，使得能在同一高效哺乳动物表达系统中生成、演化抗体或蛋白，并生产/制备蛋白。使用细菌噬菌体展示系统，在细菌中开发了许多抗体，而全长抗体主要在哺乳动物细胞中进行表达。这种相似性的缺乏，使得演化或筛选用于表达的克隆成为不可能。其它的障碍包括采用传统技术而在传统上要求有大量供筛选的突变体，并要求已经进行优化以用于表达的高水平哺乳动物表达系统，而不是突变体的大量克隆。以前没有设计出ー种整合了抗体/蛋白的筛选、演化和哺乳动物表达的系统。在哺乳动物宿主细胞中使用表面展示技术用于处理大量的分子，同时整合了在优化的哺乳动物宿主细胞内抗体/蛋白的非随机演化，增加了成功的可能性，并大大加快了在生产中想要的在哺乳动物细胞中能够以足够高水平表达的、优化的抗体/蛋白的产生进程。专利技术概要本专利技术提供在真核宿主，如哺乳动物细胞宿主或酵母细胞宿主中整合了治疗性蛋白(包括抗体)的产生和/或筛选，演化和表达的方法，以实现在单一系统中生产。在同一真核宿主系统中产生、优化并生产治疗性蛋白，包括抗体。本专利技术公开的综合性整合的抗体优化系统(CIA0 ! ) (system of Comprehensive Integrated Antibody Optimization)可同时进行蛋白性能和表达优化的演化。 在一个实施方案中，本专利技术提供在哺乳动物细胞生产宿主中筛选、演化和表达抗体的方法；该方法包括采用抗体细胞表面展示技术，在哺乳动物细胞生产宿主中生成杭-抗原抗体库；从所述库中筛选出具有至少ー种预定属性、特性或活性的库；从该库中筛选出模板抗体；采用抗体细胞表面展示技术在哺乳动物生产宿主中演化所述模板抗体以产生一组突变抗体；从所述突变抗体中筛选出具有至少ー种预定的属性、特性或活性的突变抗体；从该组突变抗体中筛选出，与所述模板抗体相比，具有优化的至少ー种预定的属性、特性或活性的高表达突变型抗体(up-mutant antibody);在与生成步骤中所用相同的哺乳动物生产宿主中表达所述高表达突变型抗体。在ー个方面，所述抗原是预先筛选出的。在另ー个方面，所述抗-抗原抗体库是人源化的抗-抗原抗体库。在ー个方面，所述哺乳动物细胞生产宿主选自下组3T3小鼠成纤维细胞、BHK21叙利亚仓鼠成纤维细胞、MDCK细胞、狗上皮细胞、Hela人类上皮细胞、PtKl鼠袋鼠上皮细胞、SP2/0小鼠血浆细胞及NSO小鼠血浆细胞、HEK 293人胚肾细胞、COS猴肾细胞、CH0、CHO-S中国仓鼠卵巢细胞、Rl小鼠胚胎细胞、E14. I小鼠胚胎细胞、Hl人类胚胎细胞、H9人类胚胎细胞、PER C. 6、人类胚胎细胞、酿酒酵母细胞或毕赤酵母细胞。在ー个具体的方面，所述哺乳动物系统是CHO-S或HEK293。在ー个方面，所述筛选步骤使用荧光激活细胞分选(FACS)。 在另ー个方面，所述演化步骤包括由含m个互补决定区(OTR)的所述模板抗体生成一组突变抗体，其中m为整数1-6，每个所述⑶R包括n个氨基酸残基，该方法包括分别生成mXn个抗体组，每组所包括的抗体成员在⑶R的单个预定位置上含X个不同的预定氨基酸残基；其中每组抗体在单个预定位置上不同；以及所形成的不同抗体成员的数目等于mXnXXo在ー个具体的方面，m是6。在ー个方面，所述演化步骤包括由所述模板抗体生成n-1个分离的突变多肽组，每组所包括的多肽成员在所述多肽的单个预定位置上含X个不同的预定氨基酸残基；其中每组多肽在单个预定位置上不同；以及所形成的不同多肽成员的数目等于 XX。在一个方面，X代表在所述模板多肽的给定位置上不存在的天然存在的19个氨基酸残基。在另ー个方面，所述筛选步骤包括检测每个多肽成员，筛选出具有至少ー种预定的属性、特性或活性的多肽；确定该多肽成员相对于所述模板多肽在所述属性、特性或活性方面的任何变化；绘制功能图谱，其中所述功能图谱是用于确定在所述突变多肽中，与模板多肽相比，产生高表达突变和/或沉默突变的位置和突变。在另ー个方面，所述的功能图谱是用来确定选自下组的ー种或多种位置和突变(a)与所述模板多肽相比，不影响该突变多肽活性的位置和突变；(b)与所述模板多肽相比，完全突变的位点；以及(C)与所述模板多肽相比，产生高表达突变的位置和突变。在另ー个方面，所述抗体片段选自重链、轻链、可变域、恒定域、高变区、互补决定区I (CDRl)、互补决定区2 (CDR2)和互补决定区3 (CDR3)。在另ー个方面，所述生成步骤包括对含有编码所述模板多肽的密码子的多核苷酸进行聚合酶扩增反应，每个待突变的密码子使用64倍简并寡核苷酸，其中每个所述的64倍简并寡核苷酸是由第一同源序列和简并N，N，N三联体序列组成的，从而生成一组子代多核苷酸；以及对所述子代多核苷酸进行克隆扩增，使由子代多核苷酸编码的多肽得以表达。根据权利要求I所述的方法，其中所述预定的属性、特性或活性选自下组蛋白-蛋白聚集下降、蛋白稳定性增强、蛋白溶解度増加、糖基化位点的引入、结合位点的引入、免疫原性下降、蛋白表达增强、抗原亲和カ増加、抗原亲和カ下降、结合亲和カ的变化、免疫原性的改变或特异性增强。在另ー个实施方案中，本专利技术提供在哺乳动物细胞生产宿主中演化和表达抗体的方法，该方法包括筛选出模板抗体；采用抗体细胞表面展示技术在哺乳动物细胞生产宿主中演化所述模板抗体，以产生一组突变抗体；从所述突变抗体中筛选出具有至少ー种预定的属性、特性或活性的突变抗体；从该组突变抗体中筛选出，与所述模板抗体相比，具有优化的至少ー种预定的属性、特性或活性的高表达突变型抗体；以及在与演化步骤中所用相同的哺乳动物细胞生产宿主中表达所述的高表达突变型抗体。在ー个方面，所述筛选步骤包括绘制功能图谱，其中所述功能图谱是用于确定在所述突变多肽中，与模板多肽相比，产生高表达突变和/或沉默突变的位置和突变。在另ー个方面，所述筛选步骤包括荧光激活细胞分选(FACS)。在ー个方面， 所述哺乳动物细胞生产宿主选自3T3小鼠成纤维细胞、ΒΗΚ21叙利亚仓鼠成纤维细胞(Syrian hamster fibroblast cell)、MDCK细胞、狗上皮细胞、Hela人类上皮细胞、PtKl鼠袋鼠上皮细胞、SP2/0小鼠血浆细胞及NSO小鼠血浆细胞、HEK 293人胚肾细胞、COS猴肾细胞、CHO、CHO-S中国仓鼠卵巢细胞、Rl小鼠胚胎细胞、E14. I小鼠胚胎细胞、Hl人类胚胎细胞、H9人类胚胎细胞以及PER C. 6、人类胚胎细胞。在ー个具体的方面，所述哺乳动物系统是CHO-S或HEK293。在另ー个方面，所述细胞生产宿主为CH0K1SV或NSO宿主细胞系。在另ー个实施方案中，本专利技术提供在真核细胞生产宿主中演化和表达蛋白的方法，该方法包括筛选出模板抗体；在真核细胞生产宿主中演化所述模板抗体，以产生ー组突变抗体；从所述突变抗体中筛选出具有至少ー种预定的属本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：杰·米尔顿·谢特，
申请(专利权)人：生物蛋白有限公司，
类型：发明
国别省市：
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