本发明专利技术涉及一种通过固相层析寻找出黄曲霉毒素B1的结合蛋白的方法，利用该方法可以快速有效地找出该毒素的结合蛋白，进而促进对该毒素的致毒机理的研究。更加具体地，该方法包含，将黄曲霉毒素B1与载体蛋白进行偶联，将偶联复合物固定在PVDF膜上，让偶联复合物与总蛋白孵育，进行非特异性洗涤和特异性洗脱并进行质谱鉴定。通过体外结合验证发现该方法得到的真菌毒素的互作蛋白准确度较高。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种通过固相层析寻找出黄曲霉毒素B1的结合蛋白的方法，利用该方法可以快速有效地找出该毒素的结合蛋白，进而促进对该毒素的致毒机理的研究。更加具体地，该方法包含，将黄曲霉毒素B1与载体蛋白进行偶联，将偶联复合物固定在PVDF膜上，让偶联复合物与总蛋白孵育，进行非特异性洗涤和特异性洗脱并进行质谱鉴定。通过体外结合验证发现该方法得到的真菌毒素的互作蛋白准确度较高。【专利说明】快速鉴定与黄曲霉毒素BI互作的宿主蛋白的方法
本专利技术属于蛋白质工程领域，具体涉及一种通过固相层析筛选与黄曲霉毒素B1结合的蛋白的方法及对其是否与AFB1具有结合性的体外验证分析。
技术介绍
真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人和动物有极大危害。历年来有大量关于真菌毒素污染粮食和作物，导致事物中毒事件的报道，其中常见到的真菌毒素有:黄曲霉毒素、黄绿青霉素、橘青霉素、T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌稀醇等。其中，黄曲霉毒素(Aflatoxins, AFT)是主要由黄曲霉{aspergillus /Yara1S)寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)产生的次生代谢产物,污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品。黄曲霉毒素在1993年被世界卫生组织的癌症研究机构划定为I类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，其毒性作用主要是对肝脏的损害。在天然食物中以黄曲霉毒素B1 (Aflatoxin B1, AFB1)最为多见，危害性也最强。动物实验表明，AFB1具有强肝脏毒性和致癌效应。一直以来科学家围绕AFB1的产毒机理、毒素的致毒机理展开了大量研究，但由于该毒素是小分子的特点，针对毒素被动物细胞吸收的机理研究很少。本专利技术设计了一种快速鉴定与AFB1互作的蛋白的方法，本专利技术通过固相亲和层析法寻找出黄曲霉毒素的结合蛋白，利用该方法可以快速有效地找出与AFB1互作的结合蛋白，为促进对该毒素的致毒机理的研究奠定基础。本方法包含，将AFB1与载体蛋白进行偶联，将毒素与载体蛋白的偶联复合物固定在PVDF膜上，让偶联复合物与宿主的总蛋白孵育，进行非特异性洗涤和特异性洗脱并进行质谱鉴定。通过该方法得到的AFB1的互作蛋白准确度高，能为毒素被动物细胞吸收机理的研究打下基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速鉴定与黄曲霉毒素BI互作的宿主蛋白的方法，通过固相层析筛选与黄曲霉毒素B1结合的蛋白的方法，及对其与AFB1是否具有结合性的体外验证分析。经此方法的筛选和验证，目前已经发现40S核糖体蛋白SA和雌二醇β脱氢酶5能与AFBi结合，是AFBi的互作蛋白。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案: 一种快速鉴定与黄曲霉毒素B1互作的宿主蛋白的方法，是先将黄曲霉毒素B1与牛血清白蛋白进行偶联，再通过固相层析的方法，筛选与黄曲霉毒素B1结合的蛋白，经质谱分析鉴定后，再通过体外结合实验验证蛋白与黄曲霉毒素B1的结合性。所述的通过固相层析的方法来筛选与黄曲霉毒素B1结合的蛋白，是将牛血清蛋白-黄曲霉毒素B1偶联复合物展示在甲醇活化后的PVDF膜上，3-5°C过夜孵育；将孵育了牛血清蛋白-黄曲霉毒素B1的PVDF膜用质量分数为2%牛血清蛋白溶液进行封闭后，将膜置于小鼠肝脏总蛋白溶液中3-5°C过夜孵育以充分结合，同时用只展示牛血清蛋白分子的PVDF膜置于小鼠肝脏总蛋白溶液中作为阴性对照；再用3-5°C预冷的磷酸盐缓冲液或磷酸盐吐温缓冲液进行非特异性洗脱，3-5°C振摇lOmin，洗涤四次，用2M的NaCl进行特异性洗脱，3-5°C振摇30min，洗脱液中的互作蛋白浓缩后进行SDS-PAGE分析，银染后取差异条带进行质谱分析鉴定。所述的通过体外结合实验验证蛋白与黄曲霉毒素B1的结合性，对经质谱鉴定的黄曲霉毒素B1互作蛋白进行基因克隆、诱导表达、纯化后，通过ELISA的方法验证相应蛋白与黄曲霉毒素B1的结合性； 所述的通过体外结合实验验证，具体步骤为:将牛血清蛋白-黄曲霉毒素B1偶联复合物包被于孔中，在3-5°C下过夜，2wt.%的牛血清蛋白溶液在37°C下封闭2 h后，加入纯化的黄曲霉毒素B1互作蛋白37°C孵育2 h，再相继加入一抗和二抗，最后相继加入TMB显色和H2SO4终止液，同时设置包被牛血清蛋白的阴性孔作为对照，经此方法验证出40S核糖体蛋白SA和雌二醇β脱氢酶5与黄曲霉毒素B1有结合性。所述的一抗为抗蛋白的His标签抗体，37°C孵育I h ;二抗为抗His抗体的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，37°C孵育I h。本专利技术的优点在于:真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人和动物有极大危害。一直以来科学家围绕真菌毒素，特别是AFB1的致毒机理展开了大量研究，但由于该毒素是小分子的特点(很难鉴定与其互作的宿主蛋白)，针对毒素被动物细胞吸收的机理，以及被细胞吸收后细胞内与其互作蛋白的了解很少。本专利技术提供了一种确实可行，并且快速简便的筛选与真菌毒素(以黄曲霉毒素为例)互作蛋白的方法，为进一步了解真菌毒素的致毒机理奠定基础。【专利附图】【附图说明】图1 AFBi的结构分子式。图2 AFB1与BSA偶联路线。图3 AFBU BSA和偶联产物三种物质的紫外扫描图；其中I为牛血清蛋白；2为黄曲霉毒素B1 ；3为牛血清蛋白-黄曲霉毒素B1偶联复合物。图4 AFBl结合蛋白的SDS-PAGE分析；其中M为Marker ;1为牛血清蛋白-黄曲霉毒素B1偶联复合物；2为牛血清蛋白；3为牛血清蛋白-黄曲霉毒素B1偶联复合物；4为牛血清蛋白；1和2泳道是PBST洗涤组，3和4是PBS洗涤组。图5鉴定的AFB1结合蛋白的体外表达与纯化。其中，A图:Rpsa蛋白的表达纯化。M:Marker ；1 =IPTG诱导PET28a菌菌液；2: IPTG诱导PET28a_rpsa重组菌菌液；3:纯化的Rpsa蛋白；B图:AkrIc6蛋白的表达纯化。M:Marker ；1:1PTG诱导PET28a菌菌液；2 =IPTG诱导PET28a-akrlc6重组菌菌液；3:纯化的Akrlc6蛋白；C图:Cyb5a蛋白的表达纯化。M:Marker ；1 =IPTG诱导PET28a菌菌液；2 =IPTG诱导PET28a_cyb5a重组菌菌液；3:纯化的Cyb5a蛋白。图6鉴定的AFB1结合蛋白与AFB1的体外结合验证。把交联产物BSA-AFBl包被在酶标孔中，再加入纯化的蛋白和一抗(抗蛋白的抗体)、二抗、显色液、终止液，测OD值，通过OD值来判断黄曲霉毒素BI与蛋白的结合性。【具体实施方式】一、聚丙烯酰胺凝胶的配制 (1)2mol/L Tris-HCl (pH8.8):称取24.2 g Tris base加适量超纯水溶解，用盐酸调PH值至8.8，加超纯水定容至100 mL。(2)1 mol/L Tris-HCl (pH6.8):称取 12.1 g Tris base 加适量超纯水溶解，用盐酸调PH值至6.8，加超纯水定容至100mL。(3)30 %丙烯酰胺储存液:称取29.2 g丙烯酰胺，0.8 g N’，N’-亚甲叉双丙烯酰胺，加超纯水溶解至100 mL，待其完全溶解后用滤纸过滤，4 °C避光保存。(4) 10 %本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速鉴定与黄曲霉毒素B1互作的宿主蛋白的方法，其特征在于：先将黄曲霉毒素B1与牛血清白蛋白进行偶联，再通过固相层析的方法，筛选与黄曲霉毒素B1结合的蛋白，经质谱分析鉴定后，再通过体外结合实验验证蛋白与黄曲霉毒素B1的结合性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：庄振宏，黄亚玲，汪世华，袁军，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：
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