条件表达治疗蛋白的载体，包含所述载体的宿主细胞，及其应用制造技术

本发明专利技术涉及治疗领域。最特别地，本发明专利技术提供生成在活化配体出现时条件表达受基因表达调节系统控制的一种或多种免疫调节剂的载体的方法和用于动物中治疗目的的应用。可以提供这些载体通过直接注射或通过体外工程改造的细胞如树突细胞来治疗多种疾病，例如肿瘤疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及治疗疾病和紊乱的基因治疗来源，所述疾病和紊乱例如癌症、溶酶体贮积症、眼病、肝病或传染病。在一个实施方式中，本专利技术提供免疫细胞或治疗支持细胞(TSC)的工程改造以表达一种或多种治疗蛋白(例如，免疫调节剂)和使用所述细胞作为治疗。在另一个实施方式中，本专利技术包含用于条件表达本文所公开治疗蛋白(例如，免疫调节剂(immunodulator))例如IL_12、TNF_a的载体，例如腺病毒，以及使用这些载体的方法。
技术介绍
白介素12(IL_12)是参与引起很多生物过程的I型细胞因子家族成员，所述生物过程包括但不限于保护性免疫反应和肿瘤发生的抑制(Abdi等，2006;Adorini, 1999;Adorini,2001;Adorini 等，2002;Adorini 等，1996;Akhtar 等，2004;Akiyama等，2000;Al-Mohanna 等，2002;Aliberti 等，1996;Al Iavena 等，1994;Alli 和Khar, 2004;Alzona 等，1996;Amemiya 等，2006;Araujo 等，2001;Arulanandam 等，1999;Athie 等，2000;Athie-Morales 等，2004;Bertagnolli 等，1992;Bhardwaj 等，1996;Biedermann 等，2006;Brunda 和 Gately,1994;Buchanan 等，1995;Romani 等，1997;Rothe 等，1996;Satoskar 等，2000;Schopf 等，1999;Thomas 等，2000;Tsung 等，1997 ;ffolf等，1994; Yuminamochi等,2007)。越来越多的证据提示IL-12可以是控制人类疾病(如癌症)的有希望的靶标。尽管事实上根据其对I型抗肿瘤NK细胞、⑶4+T细胞和⑶8+T细胞的潜在支持活性，IL-12是有希望的癌症治疗试剂(Trinchieri，2003)，但报道的患者中重组人IL-12(rhIL-12)的毒性(Atkins等，1997)与临床应用的有限GMP级rhIL_12来源共同妨碍基于IL-12治疗方案的成功。因此，基因治疗方案可代表更安全、更加可维持的治疗选择看起来是合乎情理的。确实，发现实施瘤内或瘤周递送重组病毒(Sangro等,2004; Triozzi等，2005)或基于质粒IL-12cDNA (Heinzerling等，2005)或IL-12基因修饰的自体成纤维细胞(Kang等，2001)的I期临床试验安全并良好耐受。然而，接受这些基因治疗的黑素瘤或各种癌症患者中的对象(objective)临床反应罕见、可变、短暂并且主要集中在治疗位点(Heinzerling等,2005; Kang等,2001; Sangro等，2004; Triozzi等，2005)。在疾病部分或全部解决的示例中，已经注意到癌症浸润淋巴细胞的频率增加(Heinzerling等,2005; Sangro等,2004)和循环肿瘤特异Q38+T细胞的水平增高(Heinzerling等,2005),与这些患者中抗原特异T细胞的交叉激活提高一致。因为所述特异T细胞的交叉激活最好通过作为天然但调控的IL-12来源的树突细胞(DC)来完成(Berard等，2000)，关于基于DC的IL-12基因治疗的优越的临床前功效的近期报道引起极大的兴趣(Satoh等，2002; Tatsumi等,2003; Yamanaka等,2002)。例如，显示了肿瘤内(1.t.)注射工程改造的DC以生产IL-12p70(通过重组腺病毒感染)造成广泛反应性肿瘤特异CD8+T细胞库的交叉激活显著提高，这与鼠模型中肿瘤排斥一致(Tatsumi等，2003)。鉴于原先使用基于CMV启动子的编码mIL_12的重组腺病毒(rAd.cIL12, (Tatsumi等，2003))，经工程改造DC的IL-12生成是组成型的，因此，在治疗结果方面没有解决早期肿瘤损伤内和晚期肿瘤引流淋巴结内的所述细胞因子的所述免疫影响。因此，需要工程改造用于条件表达IL-12的DC，以调节转基因表达水平和转基因活化时间。本专利技术提供用于这些细胞的有希望的治疗结果。核酸序列在患者宿主细胞或合适生理环境下表达前，目前临床前或临床试验中研究的很多治疗蛋白在患者中存在时没有显示有害的副作用。然而，一些蛋白例如肿瘤坏死因子(TNF)在正常生理组织或环境下表达时(例如，暴露于非靶标组织)，造成有害的副作用。所述蛋白的系统或甚至局部施用对很多非癌症细胞类型极其有毒，增强过敏和恶病质。另外，对TNFa的长时间暴露可以产生与急性刺激极为不同的细胞反应。基于这些原因，针对癌症的安全和有效的THFa治疗仍然难以捉摸。考虑到与通过包含感兴趣核酸序列所编码蛋白的载体组合物的基因的基因表达相关问题，仍需要用于直接注射或用于基于细胞治疗的经改善转移载体组合物。溶酶体贮积症(LSD)是一类可遗传的遗传病，能同时只被蛋白治疗剂以酶替代疗法的方式治疗。LSD是一类49种基因遗传病，特征为一种或多种溶酶体酶的缺乏造成溶酶体内未消化大分子的积累。这些废物的积累造成细胞内溶酶体变大，产生细胞损伤和变性。器官和组织中积累的损伤造成物理和 /或精神状态的进行性退化，并且最终死亡。诊断通常在幼年完成。个体疾病的严重性不同，并且与缺陷基因生成的残留酶活性量相关。LSD的发病率是5000人中约有I例(世界范围130，000例)。严重性不同，并且与缺陷基因生成的残留酶活性量相关。严重受影响的患者可能只活到十多岁，而较少受到严重影响的患者可以活到成年。酶替代疗法是治疗LSD的唯一可用方法。治疗由靶向溶酶体和降解所积累废物分子的活性蛋白的系统融合组成。LSD蛋白治疗的示例包含用于法布里病(Fabry Disease)的Fabrazyme (健赞公司(Genzyme))、用于MPSII的Elaprase (希尔公司(Shire))、和用于庞培氏病(Pompe Disease)的Myozome (健赞公司)及用于高歇病(Gaucher Disease)的Cerezyme (健赞公司)。酶替代疗法伴随有某些缺点，例如需要翻译后蛋白修饰、所述替代酶显示体内短的半衰期、和患者发展对所述替代酶的免疫反应。因此，本领域仍需要酶替代疗法和其替代方式以治疗溶酶体贮积症。
技术实现思路
本专利技术提供在一个或多个启动子控制下具有一种或多种治疗蛋白(例如免疫调节剂)功能的编码蛋白的重组载体。在一个实施方式中，所述一个或多个启动子是条件型。在另一个实施方式中，所述一个或多个启动子是组成型。在另一个实施方式中，所述载体是编码启动子驱动的蛋白的腺病毒载体，所述启动子能通过提供可溶小分子配体如二酰基肼而条件激活(例如，RG-115819、RG-115830或RG-115932)。这个载体能控制来自免疫细胞、TSC和来自直接注射包含治疗蛋白的载体中的蛋白(例如免疫调节剂)表达。在一个实施方式中，本专利技术提供用于条件表达蛋白的载体，所述蛋白有一种或多种包含编码基因开关的多核苷酸的治疗蛋白(例如免疫调节剂)功能，其中所述编码基因开关的多核苷酸包含(I)操本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.23 US 61/316,792;2010.07.22 US 61/366,731;1.一种条件表达有一种或多种具有治疗蛋白功能的蛋白的载体，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(I)操作性连接启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种有治疗蛋白功能的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸操作性连接到通过所述配体依赖性转录因子激活的启动子。2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述治疗蛋白选自下组促血红细胞生长素、生长素释放肽、骨保护素、RANKL, RANKL诱饵(decoy)、TNF-a拮抗剂、IL-1拮抗剂、G-CSF、GM-CSF、IFN- a、IFN- y、血管他汀、内皮他汀、TNF- a、PP1DCY-LSRL0C、P -葡糖苷酸酶、IL-12、a-半乳糖苷酶A、芳香基硫酸酯酶A、a-葡糖苷酶、b_葡糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、CLN6蛋白、青少年相关CLN3、N-磺氨基葡糖磺基水解酶(sulfoglucosaminesulfohyrolase) (SGSH)、a_N_乙酰氨葡萄糖苷酶、乙酰-辅酶A-氨基葡糖苷乙酰基转移酶、N-乙酰基葡糖胺-6-硫酸酯酶、a-L-艾杜糖苷酸酶(iduronidase)、芳香基硫酸酯酶B、酸性鞘磷脂酶、艾杜糖醒酸硫酸酯酶(iuduronate sulfatase)和血衆铜蓝蛋白。3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述治疗蛋白是一种或多种选自下组的免疫调节剂IL-1> IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-1OR DN 或其亚基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFNa、IFNP、IFNa1、IFNa 2、IL-15-R-a、CCL3 (MIP-1a)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP3)、XCLl (淋巴细胞趋化因子)、CXCLl (MGSA a )、CCR7、CCL19 (MIP-3b)、CXCL9 (MIG)、CXCLlO (IP-10)、CXCL12 (SDF-1)、CCL21 (6Ckine)、0X40L、4-lBBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防御素、HMGB1、Flt3L、IFNP、TNF a、dnFADD、BCG、TGF a、PD-LlRNA1、PD-L1 反义寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L、S100、CD40L、p53、存活素、p53-存活素融合、MAGE3、PSA和PSMA。4.如权利要求1-3中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体选自下组质粒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、痘病毒、杆状病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、腺病毒、双生病毒(geminivirus)、花椰菜花叶病毒、脂质体、带电脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白复合物和生物聚合物。5.如权利要求1-4中任一项所述的载体,其特征在于,所述载体是腺病毒载体。6.如权利要求1-5中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体还包含编码有IL-12功能的蛋白的多核苷酸。7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述编码所述一种或多种有免疫调节剂功能蛋白的多核苷酸和编码所述有IL-12功能蛋白的所述多核苷酸受所述基因开关调节的启动子控制。8.如权利要求1-7中任一项所述的载体，其特征在于，所述基因开关是基于蜕皮激素受:体(EcR)的基因开关。9.如权利要求1-8中任一项所述的载体，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白相互作用形成作为配体依赖性转录因子的蛋白复合物。10.如权利要求1-9中任一项所述的载体，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白相互作用形成作为配体依赖性转录因子的蛋白复合物。11.如权利要求10所述的载体，其特征在于，所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列通过EMCV内部核糖体进入位点(IRES)连接。12.如权利要求1-11中任一项所述的载体，其特征在于，所述编码一种或多种有治疗蛋白功能的蛋白的多核苷酸编码人类蛋白。13.如权利要求5-12中任一项所述的载体，其特征在于，所述编码有IL-12功能的蛋白的多核苷酸编码人IL-12。14.如权利要求3-13中任一项所述的载体，其特征在于，所述免疫调节剂是TNFa。15.如权利要求14所述的载体，其特征在于，所述免疫调节剂是人TNFa。16.如权利要求3-15中任一项所述的载体，其特征在于，所述免疫调节剂包含与SEQID NO: 37 (人 TNFa )至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%相同的氨基酸序列。17.如权利要求1-16中任一项所述的载体，其特征在于，所述编码一种或多种有治疗蛋白功能的蛋白的多核苷酸是密码子优化的。18.如权利要求17所述的载体，其特征在于，所述编码一种或多种有治疗蛋白功能的蛋白的多核苷酸还包含编码信号肽的核酸序列。19.如权利要求18所述的载体，其特征在于，所述编码信号肽的核酸序列是密码子优化的。20.如权利要求19所述的载体，其特征在于，所述信号肽选自下组=TNFOptUV和IL-2optUV021.如权利要求18-20中任一项所述的载体，其特征在于，所述信号肽与野生型TNFa信号肽基因编码的肽序列相比诱导提高的TNFa蛋白分泌。22.如权利要求1-21中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体还包含5’非翻译区(UTR)。23.如权利要求22所述的载体，其特征在于，所述5’UTR衍生自TNF野生型或5U2。24.如权利要求22或23所述的载体，其特征在于，所述5’UTR诱导提高的编码TNF a的1^嫩水平、了即0蛋白病毒表达或两者。25.如权利要求1-24中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体还包含3’调节区。26.如权利要求25所述的载体，其特征在于，所述3’调节区是衍生自SV40e或人生长激素(hGH)的聚腺苷酸化信号。27.如权利要求25或26所述的载体，其特征在于，所述3’调节区诱导提高的编码TNFa的11^嫩水平、了即0蛋白病毒表达或两者。28.如权利要求27所述的载体，其特征在于，所述载体包含衍生自5U2的5’UTR、密码子优化的IL-2信号肽(IL-2optUV)、由密码子优化的核酸序列编码的TNF- a和衍生自hGH的3’调节区。29.如权利要求1-28中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体包含选自下组的核酸序列载体43318、载体43319、载体43320、载体43321、载体43322、载体43322、载体43323、载体 43324、载体 43325、载体 43326、载体 43327 和载体 43329。30.如权利要求1-29中任一项所述的载体，其特征在于，所述条件表达所述治疗蛋白的载体直接注射入肿瘤或肿瘤附近。31.如权利要求1-30中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体在体内给予前不包含于细胞中。32.—种生成免疫细胞群或治疗支持细胞(TSC)群的方法，所述细胞表达有一种或多种治疗蛋白功能的蛋白，所述方法包含用权利要求1-31中任一项所述载体修饰免疫细胞。33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述细胞是人树突细胞。34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述树突细胞是骨髓树突细胞。35.一种表达有一种或多种治疗蛋白功能的蛋白的免疫细胞群或TSC群，所述免疫细胞或TSC群包含如权利要求1-34中任一项所述的载体。36.如权利要求35所述的免疫细胞或TSC群，其特征在于，所述细胞是人树突细胞。37.一种体外工程改造的免疫细胞或TSC，所述细胞或TSC包含如权利要求1-31中任一项所述的载体。38.如权利要求37所述的体外工程改造的免疫细胞或TSC，其特征在于，所述免疫细胞或TSC是人树突细胞。39.一种药物组合物，所述组合物包含如权利要求1-31中任一项所述的载体，如权利要求35-36中任一项所述的免疫细胞群或TSC群，如权利要求37-38中任一项所述的体外工程改造的免疫细胞群或TSC群，或其组合。40.一种组合物，所述组合物包含两种或多种如权利要求1-31中任一项所述的载体，两个或多个如权利要求35-36中任一项所述的免疫细胞群或TSC群，两种或多种如权利要求37-38中任一项所述的体外工程改造的免疫细胞或TSC，或其组合。41.如权利要求39或40所述的组合物和药学上可接受运载体。42.如权利要求39-41中任一项所述的组合物，所述组合物还包含缓冲剂。43.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述缓冲剂是TRIS。44.如权利要求39-43中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含甘油。45.如权利要求39-44中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物适于口服、玻璃体内、肿瘤内、腹膜内或皮下给予。46.如权利要求39-45中任一项所述的组合物，其特征在于，所述细胞群包含至少104细胞。47.如权利要求39-46中任一项所述的组合物，其特征在于，所述细胞群包含至少IO7细胞。48.如权利要求39-47中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物和所述活化配体同时给予或以任何顺序给予有此需要的哺乳动物时，所述组合物降低肿瘤大小或防止肿 瘤形成。49.如权利要求39-48中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物和所述活化配体同时给予或以任何顺序给予有此需要的哺乳动物时，所述组合物治疗肿瘤。50.(I)如权利要求1-31中任一项所述的载体，如权利要求35-36中任一项所述的群，如权利要求35-38中任一项所述的体外工程改造的免疫细胞或TSC，或如权利要求39-49中任一项所述的组合物，和(2)药物生产中治疗有效量的一种或多种活化配体用于制造药物的应用，所述药物用以治疗有此需要的哺乳动物的疾病或紊乱。51.如权利要求50所述的应用，其特征在于，所述疾病或紊乱是所述哺乳动物中的肿瘤。52.如权利要求50或51所述的应用，其特征在于，所述治疗是降低所述哺乳动物中肿瘤的大小或防止肿瘤。53.(I)如权利要求1-31中任一项所述的载体，如权利要求35-36中任一项所述的群，如权利要求35-38中任一项所述的体外工程改造的免疫细胞或TSC，或如权利要求39-49中任一项所述的药物组合物，和(2)药物生产中治疗有效量的一种或多种活化配体用于制造药物的应用，所述药物用于在有此需要的哺乳动物中降低、消除或控制TNFa的系统毒性，其中，所述配体与所述载体或组合物给予同时、或之前、或之后给予，并且其中活化配体给予的时间降低、消除或控制系统毒性。54.如权利要求50-53中任一项所述的应用，其特征在于，当所述哺乳动物显示副作用时，停止给予所述活化配体。55.如权利要求50-54中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体在所述载体、所述群、所述体外工程改造的免疫细胞或TSC或者所述组合物前后小于I小时内给予。56.如权利要求50-55中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体在所述载体或所述组合物之后小于24小时内给予。57.如权利要求50-55中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体在所述载体或所述组合物之后小于48小时内给予。58.如权利要求50-57中任一项所述的应用，其特征在于，所述载体不含在细胞中，并且所述载体瘤内给予所述哺乳动物中的肿瘤微环境。59.如权利要求58所述的应用，其特征在于，免疫细胞或TSC不与所述载体一样瘤内给予。60.如权利要求50-59中任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是良性肿瘤。61.如权利要求50-59中任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是恶性肿瘤。62.如权利要求50-59中任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是黑素瘤。63.如权利要求50-59中任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是恶性黑素瘤皮肤癌。64.如权利要求50-63中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体是二酰肼。65.如权利要求50-64中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体选自RG-115819、RG-115932 和 RG-115830。66.如权利要求50-63中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体是酰胺酮和恶二唑琳(oxadiazoline)。67.如权利要求50-66中任一项所述的应用，其特征在于,所述配体在所述载体、免疫细胞群或TSC群、体外工程改造的免疫细胞或组合物前后小于I小时内给予。68.如权利要求50-66中任一项所述的应用，其特征在于,所述配体在所述载体、免疫细胞群或TSC群、体外工程改造的免疫细胞或组合物之后小于24小时内给予。69.如权利要求50-66中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体在载体、免疫细胞群或TSC群、体外工程改造的免疫细胞或组合物之后小于48小时内给予。70.一种测定患者中基于如权利要求1-31中任一项所述的载体、如权利要求35-36中任一项所述的免疫细胞群或TSC群、如权利要求35-38中任一项所述的体外工程改造的免疫细胞、或如权利要求39-49中任一项所述的组合物的治疗方案功效的方法，所述方法包含 (a)在给予所述载体、免疫细胞群或TSC群、体外工程改造的免疫细胞或组合物前，从有此需要的患者获得的第一生物样品中测量干扰素Y (IFN-Y)的表达水平或活性水平或两者，从而生成对照水平； (b)给予所述患者如权利要求1-31中任一项所述的载体、如权利要求35-36中任一项所述的免疫细胞群或TSC群、如权利要求35-38中任一项所述的体外工程改造的免疫细胞、或如权利要求39-49中任一项所述的组合物； (C)给予所述患者治疗有效量的活化配体； (d)在给予载体、免疫细胞群或TSC群、体外工程改造的免疫细胞和活化配体后，从所述患者获得的第二生物样品中测量IFNy的表达水平或活性水平或两者，从而生成测试水平；和 (e)比较IFNY的所述对照水平和测试水平，其中IFNy的表达、活性或两者的测试水平相对于对照水平增加指示所述治疗方案对所述患者有效。71.—种试剂盒，所述试剂盒包含(a)如权利要求1-31中任一项所述的载体、如权利要求35-36中任一项所述的免疫细胞群或TSC群、如权利要求35-38中任一项所述的体外工程改造的免疫细胞、或如权利要求39-47中任一项所述的组合物，和(b)激活所述基因开关的配体。72.如权利要求71所述的试剂盒，其特征在于，所述配体是RG-115819、RG-115830或RG-115932。73.一种增加TNF-a mRNA表达或TNF-a蛋白表达的方法，所述方法包含(I)生成如权利要求1-31中任一项所述的载体，其中所述免疫调节剂是TNF-a且其中所述编码一种或多种有免疫调节剂功能的蛋白的多核苷酸还包含一个或多个调节序列，和(2)加入活化配体，其中所述一个或多个调节序列提高所述TNF- a的表达。74.(a)条件表达蛋白的载体，其中所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，和(b)治疗有效量的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·F·罗斯，C·C·瑞德，B·库斯博特森，S·查达，W·E·佛格勒，
申请(专利权)人：英特瑞克斯顿股份有限公司，
类型：
国别省市：