共济蛋白表达构建体制造技术

本发明专利技术提供了表达共济蛋白的多核苷酸、载体和病毒以及治疗弗里德赖希氏共济失调的方法。

Free protein expression construct

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】共济蛋白表达构建体序列表的引用本申请以引用的方式并入“序列表”(下文鉴定)，所述序列表经由美国专利局的电子提交系统(EFS)以文本文件格式同时随同提交。随同提交的序列表的文本文件副本标记为“INX00317PCT_ST25”，是大小为40.298字节的文件，并且于2017年10月4日创建。该序列表以引用的方式整体并入本文。
技术介绍
弗里德赖希氏共济失调(Friedreich’sAtaxia，FA)是最常见形式的可遗传的共济失调，并且影响美国50,000人中的约1人。弗里德赖希氏共济失调由存在于染色体9上的编码共济蛋白基因(FXN)的基因中的突变引起。FA的潜在分子病理学是由于FXN的第一个内含子中三核苷酸GAA重复扩增(70-1700)的存在(Campuzano等人(1996)Hum.Mol.Genet.6:1771-1780)。该基因突变的效果是不足数量的线粒体蛋白质共济蛋白的产生，所述线粒体蛋白质共济蛋白看起来在铁稳态中起重要作用(Pandolfo(2008)ArchivesofNeurology65:1296-1303；Campuzano等人(1996)Hum.Mol.Genet.6:1771-1780)。共济蛋白蛋白质的水平减少与线粒体功能障碍有关，并且导致细胞毒性和细胞死亡(Pandolfo(2009)J.Neurol.256Suppl.1:3-8)。缺陷基因的杂合子携带者表达大约50％的正常共济蛋白蛋白质水平，并且是无症状的；纯合子患者表达5-25％的正常共济蛋白水平，并且是有症状的。因此，可能的是，FA患者的CNS中的细胞中共济蛋白蛋白质水平的适度增加会导致显著的神经学改善。此外，增加内源性FXN水平或FXN蛋白替换方法的分子在临床和临床前研究中已显示出前景。因此，经由基因疗法的蛋白质替换是治疗开发的引人注目的替代选项。本领域迫切需要弗里德赖希氏共济失调的治疗和预防。
技术实现思路
本专利技术提供了包含编码人共济蛋白的核酸分子的多核苷酸，所述核酸分子与指导其转录和翻译的控制元件可操作地连接。在本专利技术的一些实施例中，核酸编码其氨基酸序列与SEQIDNO:1至少80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的共济蛋白蛋白质。在本专利技术的一些实施例中，核酸编码具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的共济蛋白蛋白质。在一些实施例中，控制元件选自启动子、5'调节元件、3'调节元件及其组合。在一些实施例中，启动子选自CMV启动子、UBC启动子、EF1α启动子、PGK1启动子和最小共济蛋白启动子。在一些实施例中，5'调节元件选自GAPDH序列、FTH1-5'UTR、RPL6-5'剪接序列和5U2序列。在一些实施例中，3'调节元件选自SV40早期序列、SV40晚期序列、合成的3'调节元件和人生长激素多腺苷酸化序列。在本专利技术的一个特定实施例中，核酸编码具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质，并且控制元件包含UBC启动子(例如，SEQIDNO:3)、5U2序列(例如，SEQIDNO:4)和人生长激素多腺苷酸化序列(例如，SEQIDNO:5)。在本专利技术的另一个特定实施例中，核酸编码具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质，并且控制元件包含UBC启动子(例如，SEQIDNO:3)、5U2序列(例如，SEQIDNO:4)和合成的3'调节元件序列(SEQIDNO:7)。本专利技术还提供了包含本专利技术的多核苷酸的病毒载体。在一些实施例中，病毒载体是腺相关病毒载体。在一个具体实施例中，病毒载体是AAV5。本专利技术还提供了包含病毒载体的重组病毒粒子，并且其中所述病毒载体包含编码人共济蛋白的核酸分子，所述核酸分子与指导其转录和翻译的控制元件可操作地连接。在一些实施例中，病毒粒子含有腺相关病毒载体。在某些具体实施例中，腺相关病毒载体是AAV5。在一些实施例中，病毒粒子包含编码具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质的核酸分子。在一些实施例中，控制元件选自启动子、5'调节元件、3'调节元件及其组合。在一些实施例中，启动子选自CMV启动子(例如，SEQIDNO:13)、UBC启动子(例如，SEQIDNO:3)和EF1α启动子(例如，SEQIDNO:18)、PGK1启动子(例如，SEQIDNO:17)和最小共济蛋白启动子。在一些实施例中，5'调节元件选自GAPDH(例如，SEQIDNO:15)序列、FTH1-5'UTR(例如，SEQIDNO:14)，RPL6-5'剪接序列(例如，SEQIDNO:16)和5U2序列(SEQIDNO:4)。在一些实施例中，3'调节元件选自SV40早期序列(例如，SEQIDNO:8)、SV40晚期序列(例如，SEQIDNO:9)、合成的3'调节元件序列(SEQIDNO:7)和人生长激素多腺苷酸化序列(例如，SEQIDNO:5)。在某些具体实施例中，核酸编码具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质，所述启动子是UBC启动子(SEQIDNO:3)，并且所述调节元件是5U2序列(SEQIDNO:4)和人生长激素多腺苷酸化序列(SEQIDNO:5)。在其它具体实施例中，核酸编码具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质，启动子是UBC启动子(SEQIDNO:3)，并且所述调节元件是5U2序列(SEQIDNO:4)和合成的3'调节元件序列(SEQIDNO:7)。本专利技术还提供了包含以下的组合物：(a)病毒载体，其中所述病毒载体包含编码人共济蛋白的核酸分子，所述核酸分子与指导其转录和翻译的控制元件可操作地连接；以及(b)药学可接受的赋形剂。在一些实施例中，载体是腺相关病毒载体。在某些具体实施例中，腺相关病毒载体是AAV5。在一些实施例中，核酸编码其氨基酸序列与SEQIDNO:1至少80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的共济蛋白蛋白质。在一些实施例中，控制元件选自启动子、5'调节元件、3'调节元件及其组合。在一些实施例中，启动子选自CMV启动子(例如，SEQIDNO:13)、UBC启动子(例如，SEQIDNO:3)和EF1α启动子(例如，SEQIDNO:18)、PGK1启动子(例如，SEQIDNO:17)和最小共济蛋白启动子。在一些实施例中，5'调节元件选自GAPDH(例如，SEQIDNO:15)、FTH1-5'UTR(例如，SEQIDNO:14)、RPL6-5'剪接序列(例如，SEQIDNO:16)和5U2序列(SEQIDNO:4)。在一些实施例中，3'调节元件选自SV40早期序列(例如，SEQIDNO:8)、SV40晚期序列(例如，SEQIDNO:9)、合成的3'调节元件序列(SEQIDNO:7)和人生长激素多腺苷酸化序列(例如，SEQIDNO:5)。在某些具体实施例中，核酸编码具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质，所述启动子是UBC启动子(SEQIDNO:3)，并且所述调节元件是5U2序列(SEQIDNO:4)和人生长激素多腺苷酸化序列(SEQIDNO:5)。在某些其它具体实施例中，核酸编码具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质，所述启动子是UBC启动子(SEQIDNO:3)，并且所述调节元件是5U2序列(SEQIDNO:4)和合成的3'调节元件序列(SEQIDNO:7)。本专利技术还提供了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含编码人共济蛋白多肽的核酸分子的多核苷酸，所述人共济蛋白多肽具有与5'UTR可操作地连接的SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列，其中所述5'UTR是5U2、FTH1、GAPDH或RPL6‑5’剪接。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.09 US 62/419,6211.一种包含编码人共济蛋白多肽的核酸分子的多核苷酸，所述人共济蛋白多肽具有与5'UTR可操作地连接的SEQIDNO:1至少80％相同的氨基酸序列，其中所述5'UTR是5U2、FTH1、GAPDH或RPL6-5’剪接。2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述核酸编码具有与SEQIDNO:1至少85％相同的氨基酸序列的蛋白质。3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述核酸编码具有与SEQIDNO:1至少90％相同的氨基酸序列的蛋白质。4.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述核酸编码具有与SEQIDNO:1至少90％相同的氨基酸序列的蛋白质。5.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述核酸编码具有与SEQIDNO:1至少95％相同的氨基酸序列的蛋白质。6.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述核酸编码具有与SEQIDNO:1至少98％相同的氨基酸序列的蛋白质。7.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述核酸编码具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质。8.根据权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，其中编码人共济蛋白多肽的所述核酸分子与至少一种控制元件可操作地连接，其中所述控制元件是启动子、3'调节元件或其组合。9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中所述启动子是诱导型启动子。10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其还包含调节来自所述诱导型启动子的表达的基因开关。11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中所述基因开关是基于蜕皮激素受体(EcR)的基因开关。12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中所述基于蜕皮激素受体(EcR)的基因开关是RHEOSWITCHTHERAPEUTIC基因开关。13.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中所述启动子是CMV启动子、UBC启动子、EF1α启动子、PGK1启动子或最小共济蛋白启动子。14.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中所述3'调节元件是SV40早期序列、SV40晚期序列、具有SEQIDNO:7的核酸序列的合成3'调节元件、或人生长激素多腺苷酸化序列。15.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中所述核酸编码具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质，并且所述控制元件包含UBC启动子、5U2序列和人生长激素多腺苷酸化序列。16.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中所述核酸编码具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质，并且所述控制元件包含UBC启动子、5U2序列和具有SEQIDNO:7的核酸序列的合成3'调节元件。17.一种病毒载体，其包含根据权利要求1至16中任一项所述的多核苷酸。18.根据权利要求17所述的病毒载体，其中所述载体是腺相关病毒载体。19.根据权利要求18所述的病毒载体，其中所述腺相关病毒载体是AAV5。20.一种重组病毒粒子，其包含病毒载体，其中所述载体包含编码人共济蛋白的核酸分子，所述核酸分子与5'UTR和控制元件可操作地连接，其中所述5'UTR是5U2、FTH1、GAPDH或RPL6-5'剪接，所述控制元件指导转录和翻译。21.根据权利要求20所述的病毒粒子，其中所述载体是腺相关病毒载体。22.根据权利要求21所述的病毒粒子，其中所述腺相关病毒载体是AAV5。23.根据权利要求20至22中任一项所述的病毒粒子，其中所述核酸编码具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的蛋白质。24.根据权利要求20至23中任一项所述的病毒粒子，其中所述控制元件是启动子、3'调节元件或其组合。25.根据权利要求24所述的病毒粒子，其中所述启动子是诱导型启动子。26.根据权利要求25所述的病毒粒子，其还包含调节来自所述诱导型启动子的表达的基因开关。27.根据权利要求26所述的病毒粒子，其中所述基因开关是基于蜕皮激素受体(EcR)的基因开关。28.根据权利要求27所述的病毒粒子，其中所述基于蜕皮激素受体(EcR)的基因开关是RHEOSWITCHTHERAPEUTIC基因开关。29.根据权利要求24所述的病毒粒子，其中所述启动子是CMV启动子、UBC启动子、EF1α启动子、PGK1启动子或最小共济蛋白启动子...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·肖尔，D·托马斯，G·鲁滨逊，M·皮科特，R·索恩，K·格鲁伊斯，
申请(专利权)人：英特瑞克斯顿股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US