重组病毒复制子体系及其用途制造技术

本公开整体涉及根据基于病毒的表达体系，其适用于制备感兴趣的分子。本公开涉及核酸构建体，诸如表达载体，其包含经修饰的复制子RNA，所述经修饰的复制子RNA包含经修饰的5'‑非翻译区(5'‑UTR)，并且任选地已经缺失编码结构化蛋白质的初始病毒序列中的至少一些。本发明专利技术还公开了用于制备感兴趣的多肽的方法。

Recombinant virus replicon system and its application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组病毒复制子体系及其用途相关申请本专利申请根据119USC§35要求2016年10月17日提交的美国临时专利申请62/409228的优先权，该文献全文以引用方式明确地并入本文。并入序列列表随附的序列列表中的材料据此以引用方式并入本专利申请中。名称为SGI011WO_SeqListing.txt的随附序列列表文本文件在2017年10月3日创建，并且为34KB。
本公开涉及分子生物学领域，其包括包含经修饰的病毒复制子的核酸分子以及此类核酸分子用于在细胞培养物中或活体中的合适宿主细胞中产生期望产物的用途。
技术介绍
近年来，若干不同的动物病毒组已通过同源重组或对其基因组的直接工程化进行了基因操纵。DNA和RNA病毒的反向遗传学系统的可用性为重组病毒的使用创造了新的前景，例如，作为疫苗、表达载体、抗肿瘤剂、基因治疗载体和药物递送载体。例如，许多基于病毒的表达载体已被部署用于在培养的重组细胞中表达异源蛋白质。具体地讲，经修饰的病毒载体在宿主细胞中的基因表达的应用继续扩大。这方面的最新进展包括进一步开发用于生产多亚基蛋白质复合物的技术和体系，以及蛋白质修饰酶的共表达以改善异源蛋白质生产。关于病毒表达载体技术的其他最新进展包括用于控制基因表达、制备病毒载体、体内基因治疗应用和产生疫苗递送载体的许多先进的基因组工程化应用。然而，仍然需要用于在重组表达体系中表达感兴趣的基因的更有效的方法和体系。
技术实现思路
本段提供了对本专利申请的一般概述，并且不包括其全部范围或其所有特征。在一个方面，本文公开了一种包括经修饰的复制子RNA的核酸分子，其中该经修饰的复制子RNA包括经修饰的5'-UTR并且缺乏编码病毒结构化蛋白质的核酸序列的至少一部分。在本公开的该方面和其他方面的各种实施方案中，本文所公开的核酸分子可包括下列特征中的一个或多个。在一些实施方案中，经修饰的复制子RNA为经修饰的甲病毒复制子RNA。在一些实施方案中，经修饰的甲病毒复制子RNA包括经修饰的甲病毒基因组。在一些实施方案中，经修饰的5'-UTR包括在位置1、2、4、或它们的组合处的一个或多个核苷酸置换。在一些实施方案中，该核苷酸置换中的至少一个为在经修饰的5'-UTR的位置2处的核苷酸置换。在一些实施方案中，在经修饰的5'-UTR的位置2处的核苷酸置换是U->G置换。在一些实施方案中，核酸分子包括缺乏相当大部分的编码病毒结构化蛋白质的核酸序列的经修饰的复制子RNA。在一些实施方案中，本文所公开的经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA不包括编码病毒结构化蛋白质的核酸序列。在本公开的这个方面和其他方面的各种实施方案中，核酸分子还包括一个或多个表达盒，其中表达盒中的每一个包括可操作地连接到异源核酸序列的启动子。在一些实施方案中，核酸分子包括至少两个、三个、四个、五个或六个表达盒。在一些实施方案中，表达盒中的至少一个的启动子为或包含26S亚基因组启动子。在一些实施方案中，本文所公开的表达盒中的至少一个的异源核酸序列包括感兴趣的基因(GOI)的编码序列。在一些实施方案中，GOI编码选自下列的多肽：治疗性多肽、预防性多肽、诊断性多肽、营养性多肽、工业酶和报告多肽。在一些实施方案中，GOI编码选自下列的多肽：抗体、抗原、免疫调节剂、和细胞因子。在一些具体的实施方案中，GOI的编码序列被优化用于以高于参考编码序列的表达水平的水平进行表达。在一些实施方案中，核酸分子包括经修饰的复制子RNA，所述经修饰的复制子RNA包括病毒的经修饰的基因组或复制子RNA，所述病毒属于披盖病毒(Togaviridae)家族的甲病毒属。在一些实施方案中，经修饰的基因组或复制子RNA具有属于VEEV/EEEV组、或SF组或SIN组的甲病毒。在一些实施方案中，甲病毒选自：东部马脑炎病毒(EEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、沼泽地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、那皮舒纳病毒(PIXV)、米德堡病毒(MIDV)、奇昆古尼亚病毒病(CHIKV)、阿尼昂-尼昂病毒(ONNV)、罗斯河病毒(RRV)、巴马森林病毒(BF)、盖塔病毒(GET)、鹭山病毒(SAGV)、贝巴鲁病毒(BEBV)、马雅罗病毒(MAYV)、乌纳病毒(UNAV)、辛德毕斯病毒(SINV)、奥拉病毒(AURAV)、沃达罗河病毒(WHAV)、巴班肯病毒(BABV)、孜拉加奇病毒(KYZV)、西部马脑炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜穆病毒(NDUV)、和博吉河病毒。在一些实施方案中，甲病毒为委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)。一些实施方案提供核酸分子，该核酸分子包括可操作地连接至异源调控元件的经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA。在一些实施方案中，该异源调控元件包括启动子序列。在一些实施方案中，该启动子序列包括T7启动子序列。在一些实施方案中，该异源调控元件包括转录终止序列。在一些实施方案中，该转录终止序列为或包含T7终止序列。在一些实施方案中，如本文所公开的核酸分子包括经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA，其中所述核酸分子表现出与SEQIDNO：1的核酸序列的至少80％序列同一性，其中所述经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA在5'-非翻译区(5'-UTR)的位置2处包含U->G置换，并且缺乏编码病毒结构化蛋白质的序列的至少一部分。在一些实施方案中，该核酸分子表现出与SEQIDNO：1的核酸序列的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包括经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA，其中所述经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA包含5'-UTR，所述5'-UTR表现出与SEQIDNO:2-18中的至少一者的核酸序列的至少80％序列同一性，和在所述5'-UTR的位置2处的U->G置换，并且其中所述经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA缺乏编码病毒结构化蛋白质的序列的至少一部分。在一些实施方案中，经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA包含5'-UTR，所述5'-UTR表现出与SEQIDNO:2-18中的至少一者的核酸序列的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA缺乏相当大一部分的编码病毒结构化蛋白质的核酸序列。在某些实施方案中，经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA不包含编码病毒结构化蛋白质的核酸序列。在一个方面，本文所公开的一些实施方案涉及包含本文所述的核酸分子的重组细胞。在一些实施方案中，该重组细胞为原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，该重组细胞为动物细胞。在一些实施方案中，该重组细胞为脊椎动物细胞或无脊椎动物细胞。在一些实施方案中，该重组细胞选自：马肺动脉内皮细胞、马真皮细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、兔肾细胞、小鼠肌细胞、小鼠结缔组织细胞、人子宫颈细胞、人表皮喉细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人HEK-293细胞、小鼠3T3细胞、Vero细胞、Madin-Darby犬肾上皮细胞(MDCK)、原代鸡成纤维细胞、HuT78细胞、A549肺细胞、HeLa细胞、细胞、WI-38细胞、MRC-5细胞、FRhL-2和CE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含经修饰的复制子RNA的核酸分子，其中所述经修饰的复制子RNA包含经修饰的5’‑UTR并且缺乏编码病毒结构化蛋白质的核酸序列的至少一部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.17 US 62/409,2281.一种包含经修饰的复制子RNA的核酸分子，其中所述经修饰的复制子RNA包含经修饰的5’-UTR并且缺乏编码病毒结构化蛋白质的核酸序列的至少一部分。2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述经修饰的复制子RNA为经修饰的甲病毒复制子RNA。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其中所述经修饰的甲病毒复制子RNA包括经修饰的甲病毒基因组。4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的5'-UTR包含在位置1、2、4、或它们的组合处的一个或多个核苷酸置换。5.根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述核苷酸置换中的至少一个是在所述经修饰的5'-UTR的位置2处的核苷酸置换。6.根据权利要求5所述的核酸分子，其中在所述经修饰的5'-UTR的位置2处的所述核苷酸置换为U->G置换。7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的复制子RNA缺乏相当大部分的编码病毒结构化蛋白质的核酸序列。8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA不包含编码病毒结构化蛋白质的核酸序列。9.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸分子，其还包含一个或多个表达盒，其中所述表达盒中的每一个包含可操作地连接至异源核酸序列的启动子。10.根据权利要求1至9中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的复制子RNA包含病毒的经修饰的基因组或复制子RNA，所述病毒属于披盖病毒(Togaviridae)家族的甲病毒属。11.根据权利要求10所述的核酸分子，其中所述经修饰的基因组或复制子RNA具有属于VEEV/EEEV组、或SF组、或SIN组的甲病毒。12.根据权利要求10所述的核酸分子，其中所述甲病毒为委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)。13.根据权利要求1至12中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA可操作地连接至异源调控元件。14.一种包含经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA的核酸分子，其中所述核酸分子表现出与SEQIDNO：1的核酸序列的至少80％序列同一性，其中所述经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA包含在5'-非翻译区(5'-UTR)的位置2处的U->G置换，并且缺乏编码病毒结构化蛋白质的序列的至少一部分。15.根据权利要求14所述的核酸分子，其中所述核酸分子表现出与SEQIDNO：1的核酸序列的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。16.一种包含经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA的核酸分子，其中所述经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA包含5'-UTR，所述5'-UTR表现出与SEQIDNO:2-18中的至少一种的核酸序列的至少80％序列同一性，和在所述5'-UTR的位置2处的U->G置换，并且其中所述经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA缺乏编码病毒结构化蛋白质的序列的至少一部分。17.根据权利要求16所述的核酸分子，其中所述经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA包含5'-UTR，所述5'-UTR表现出与SEQIDNO:2-18中的至少一种的核酸序列的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。18.根据权利要求14至17中任一项所述的核酸分子，其中所述经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA缺乏相当大部分的编码病毒结构化蛋白质的核酸序列。19.根据权利要求14至18所述的核酸分子，其中所述经修饰的甲病毒基因组或复制子RNA不包含编码病毒结构化蛋白质的核酸序列。20.一种重组细胞，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的核酸分子。21.根据权利要求20所述的重组细胞，其中所述重组细胞为原核细胞或真核细胞。22.根据权利要求20所述的重组细胞，其中所述重组细胞为动物细胞。23.一种用于制备感兴趣的多肽的方法，所述方法包括培养包含核酸分子的宿主细胞，所述核酸分子包含经修饰的复制子RNA，其中所述经修饰的复制子RNA包含经修饰的5'...

【专利技术属性】
技术研发人员：库尔特·艾弗·卡姆鲁德，
申请(专利权)人：合成基因组公司，
类型：发明
国别省市：美国,US