体外连接和组合装配核酸分子的方法技术

本发明专利技术涉及体外连接两个或更多个感兴趣的双链(ds)或单链(ss)DNA分子的方法，其中每对的第一DNA分子的远端区域和第二DNA分子的近端区域共享序列同一性区域。所述方法允许以预先确定的顺序和方向连接大量DNA片段，而不使用限制酶。其可以用来例如连接感兴趣的基因或基因组合成产生的亚片段。还公开了用于进行所述方法的试剂盒。连接DNA分子的方法可以用来产生组合文库，所述组合文库用于通过密码子优化、基因优化和途径优化产生例如最佳蛋白表达。

Method for in vitro ligation and assembly of nucleic acid molecules

The present invention relates to a method for in vitro ligation of two or more interesting double stranded (DS) or single stranded (SS) DNA molecules, where the terminal region of the first DNA molecule of each pair and the proximal region of the second DNA molecule share the sequence identity region. The method allows a large number of DNA fragments to be connected in predetermined order and direction without the use of restriction enzymes. It can be used, for example, by linking the genes or genes that are interested in the production of sub fragments. A kit for carrying out the method is also disclosed. The method of linking DNA molecules can be used to generate combinatorial libraries, which are used for codon optimization, gene optimization, and route optimization to produce optimal protein expression, for example.

【技术实现步骤摘要】
体外连接和组合装配核酸分子的方法本申请是专利技术名称为“体外连接和组合装配核酸分子的方法”、申请号为“200980113021.1”、申请日为2009年2月13日的申请的分案申请。相关申请的交叉参考本申请要求2008年2月15日提交的美国申请序列号61/029,312；2008年2月15日提交的U.S.61/064,107；2008年5月12日提交的U.S.61/052,614；2008年9月18日提交的U.S.61/098,202；和2008年12月31日提交的U.S.61/142,101的权益。这些申请的内容通过引用全部并入本文。
本专利技术涉及体外连接单链和/或双链核酸分子的方法，其允许有效地一步装配多个具有重叠末端序列的核酸分子。本专利技术方法在实施系统组合装配核酸序列变体片段以修饰被连接核酸序列的性质中是特别有用的，核酸序列例如提供密码子使用、控制序列、基因、途径、染色体、染色体外核酸和基因组的变体的核酸序列。
技术介绍
基于循环变温仪的两步法被用来装配部分生殖道枝原体(M.genitalium)基因组，如Gibson,D.G.等,“Completechemicalsynt本文档来自技高网...

【技术保护点】
连接一组两个或更多个双链(ds)或单链(ss)DNA分子的体外方法，其中待连接的邻近DNA分子在其末端处含有重叠序列，所述方法包括将所述两个或更多个DNA分子在有效连接所述两个或更多个DNA分子以在一步反应中形成第一装配dsDNA分子的条件下在单个容器中在体外与下列接触(a)缺少3′核酸外切酶活性的分离的非热稳定5′至3′核酸外切酶，(b)群集剂，(c)具有3′核酸外切酶活性的分离的热稳定非链置换DNA聚合酶，或者所述DNA聚合酶与缺少3′核酸外切酶活性的第二DNA聚合酶的混合物，(d)分离的热稳定连接酶，(e)dNTP的混合物，以及(f)适合的缓冲液。

【技术特征摘要】
2008.02.15 US 61/064,107;2008.02.15 US 61/029,312;1.连接一组两个或更多个双链(ds)或单链(ss)DNA分子的体外方法，其中待连接的邻近DNA分子在其末端处含有重叠序列，所述方法包括将所述两个或更多个DNA分子在有效连接所述两个或更多个DNA分子以在一步反应中形成第一装配dsDNA分子的条件下在单个容器中在体外与下列接触(a)缺少3′核酸外切酶活性的分离的非热稳定5′至3′核酸外切酶，(b)群集剂，(c)具有3′核酸外切酶活性的分离的热稳定非链置换DNA聚合酶，或者所述DNA聚合酶与缺少3′核酸外切酶活性的第二DNA聚合酶的混合物，(d)分离的热稳定连接酶，(e)dNTP的混合物，以及(f)适合的缓冲液。2.权利要求1所述的方法，其中(a)的所述核酸外切酶是T5核酸外切酶并且所述接触是在等温条件下。3.权利要求1的所述方法，其中(b)的所述群集剂是PEG，和/或(c)的所述非链置换DNA聚合酶是PhusionTMDNA聚合酶或DNA聚合酶，和/或(d)的所述连接酶是Taq连接酶。4.权利要求1所述的方法，其中所述条件还适于在所述连接反应后消化任何不成对的非同源的单链DNA。5.权利要求4所述的方法，其中所述待连接DNA分子中至少一些在一个末端包含与任意感兴趣的所述DNA分子不同源的序列。6.权利要求5所述的方法，其中所述非同源序列包含一个或更多个PCR引物的结合区域，和/或与载体序列同源的区域，和/或一个或更多个限制酶的识别位点。7.权利要求1-6中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·C·文特尔，D·G·吉布森，H·O·史密斯，C·A·哈奇森三世，L·扬，
申请(专利权)人：合成基因组公司，
类型：发明
国别省市：美国,US