含有小分子干扰核糖核酸的喷雾剂制造技术

本发明专利技术提供了一种含有小分子干扰核糖核酸的喷雾剂。本发明专利技术的喷雾剂含有针对经呼吸道传播的病毒基因组的高保守序列设计的小分子干扰核糖核酸。并且本发明专利技术还将小分子干扰核糖核酸用脂质体包裹以提高其生物利用率。在病毒感染的窗口期对周边地区感染和怀疑可能感染的群体施用本发明专利技术的喷雾剂，能有效阻遏病毒的繁殖，阻断疫情的扩散或阻止其发病。等待其自生免疫抗体的产生。本发明专利技术喷雾剂的生物利用率高，副反应低，成本低，使用简单方便。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程技术应用领域，具体涉及一种含有小分子干扰核糖核酸的喷雾剂。
技术介绍
早期存在于少数植物中的转录后基因沉默现象被认为是一种很奇特的现象。但近几年却 成了分子生物学的热门话题。1995年，Guo和Kemphues发现双链DNA( dsDNA)可在C.elegans 中引起基因沉默现象。1998年，Andy Fire和Craig Mello在蠕虫中也发现同样的现象，并正 式将RNA干扰(RNAinterfernece， RNAi)名词用于基因沉默机制中。2001年Tom Tuschl，s的 研究组发现 一 种小型干扰RNA(small interferencing RNAs ， siRNA)在哺乳动物细胞中可引起基 因沉默。这种在哺乳动物中针对基因特异性降解的现象的发现为功能基因组学研究提供了新 的有力工具，也为抗病毒感染和药物开发开辟了新的领域。RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的特异同源耙基因转录后沉默的过程。RNAi可以通 过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA,诱导内源靶基因mRNA降解，达到阻 止基因表达的目的，所以RNAi可以作为一种简单、有效的可代替基因敲除技术来抑制特定基 因表达的有力遗传工具。RNAi技术作为新兴的基因阻断技术具有明显优势，它具有高度特异 性，靶基因中一个碱基的改变就会使RNAi效率大幅下降，因此它可以使等位基因特异性沉默； 它的高效性可使靶基因表达的蛋白量下降90%以上。它比反义核酸技术有效，比基因敲除技 术简单，已经迅速广泛地应用到基因功能研究、基因表达调控机制和抗病毒感染等热门领域， 并为基因治疗开辟了全新的途径。弓I起RNAi的小分子干扰RNA可以是双链RNA(siRNA),也可以是双链茎环结构的短发 夹状RNA(shRNA)，也可以是单链microRNA。 shRNA是siRNA的前体，在生物体内通过特定 的RNA酶转化成siRNA。 microRNA(miRNA)为单链RNA,它能够与mRNA的3'非翻译区互补 配对(50—85%),引起翻译受阻，但不降解mRNA。 siRNA约为19-25bp和microRNA约为19-25 nt,由长的双链RNA前体经RNaseIII酶切形成。RNA干扰现象是植物抗病毒感染的一个主要机制。但在哺乳动物中是否作为一种天然的 抗病毒防疫屏障还不是很清楚。但最近的多篇体外实验的报道，已显示了 siRNA的抗病毒效 果。Gitlin等人在进行脊髓灰质炎病毒(和FMDV同属于细小病毒科成员)的病毒复制的研 究过程中发现，针对病毒基因组不同区域而设计合成的siRNA能有效的抑制病毒的繁殖。数 据显示同时在脊髓灰质炎病毒的RNA合成和蛋白合成水平上，滴度下降97-99%。同时结果 也显示，不是所有设计出来的siRNA对病毒复制都有阻断作用，但经过筛选，siRNA的沉默 效果可达70~90%。这是因为RNA 二级结构和三级结构以及RNA和蛋白之间的相互作用都 会影响到siRNA的工作效能。最令人感到兴奋的是来自于中国学者的实验结果，他们直接设计筛选到一个针对FMDV O/HKN/2002亚型的VP1结构蛋白编码区域的siRNA/shRNA，首先对BHK-21细胞株进行转 染，然后用同源性和非同源性的FMDV病毒以及假性狂犬病毒感染细胞，感染后24小时观察细胞病变的情况，siRNA明显的延缓了同源性FMDV的细胞病变效应，而非同源性的FMDV (仅和同源性的FMDV有2个核甘酸不同)和假性狂犬病毒产生了典型的细胞病变。表明 siRNA抑制作用的特异性极佳。作者还进行了小鼠的动物模型实验，所有对照组的小鼠在感 染了病毒后的1-2天内，全部死亡。而低剂量(20 LD5o)注射了 VP1特异性的shRNA的小 鼠有75%的存活，髙剂量(100 LD5o)的有20%的存活。虽然有些学者对实验的应用前景提 出了某些担忧的问题，这主要是基于此类病毒的高变异度，广泛的宿主范围，以及不同血清 型病毒合并感染引起的疫情爆发的潜在危害性而造成的siRNA在防治的有效性，可行性和安 全性方面所面临的问题。例如不同宿主动物，不同的病程，以及不同的给药剂量和给药方式， 目前都还缺乏临床的实验资料。不过下面的另一研究成果给了我们足够的信心。这一研究成果同样来自于中国学者，他们利用siRNA抑制剂在SARS感染的恒河猴动物 模型上成功地抑制了病毒的复制，阻断了病情的发展，从而达到了治疗的效果。比较了三种 剂量的治疗方案，对其有效性和安全性进行了评估。通过对SARS相关症状的观察，SARS病 毒RNA量的测定和肺组织病理学以及免疫组织化学各项指标均显示了 siRNA对SARS预防 和治疗方面的有效性。且siRNA累计剂量为10-40mg/kg时，都没有产生siRNA诱导的毒性 作用。这对于像SARS这样的急性传染病开发新的特异性的治疗药物提供了美好的前景。以上这些结果表明，RNAi技术作为一种全新的抑制基因表达的技术，在抗病毒感染方面 显示出广阔的前景，因为它与其他抗病毒手段相比有显著的优点其一它只降解同源基因 mRNA,对非同源基因表达没有影响；其二能高效抑制病毒复制，比反义RNA技术高出近两 个数量级，当病毒基因在某个区域突变时，可以针对另一个区域重新设计siRNA,以达到持 久抑制的目的；其三RNAi可以阻断病毒受体的表达，切断病毒感染途径；其四对已整合入宿 主细胞基因组的病毒RNAi也可以起到有效的抑制作用，RNAi可作为一种高度特异性的基因 治疗策略用于病毒感染的防治。甲型和乙型流感病毒的RNA由8个节段组成，丙型流感病毒则比他们少一个节段，第1、 2、 3个节段编码的是RNA多聚集酶，第4个节段负责编码血凝素,抗原性易变；第5个节段 负责编码核蛋白,抗原性较稳定，第6个节段编码的是神经氨酸酶，抗原性易变；第7个节段 编码基质蛋白，抗原性稳定,第8个节段编码的是一种能起到拼接RNA功能的非结构蛋白， 抗原性稳定,这种蛋白的其他功能尚不得而知。丙型流感病毒缺少的是第六个节段，其第四节 段编码的血凝素可以同时行使神经氨酸酶的功能。在感染人类的三种流感病毒中，甲型流感 病毒有着极强的变异性，乙型次之，而丙型流感病毒的抗原性非常稳定。因而流行性感冒的 功能保守区在编码核蛋白的第五节，编码基质蛋白的第七节和编码非结构蛋白的第八节。(对于 流感病毒，我们研究的焦点主要集中于那些保守的病毒基因组，特别是那些不同病毒亚型的 NP, PA， PB1, PB2， M，和NS节段。由于病毒亚型之间的变异很大，所以我们这里没有设计 HA和NA的小干扰RNA。)因此，除了第4和第6节段，其他所有的节段都可用来设计小干 扰RNA。由于流感病毒C型比较常见，也很少引起临床症状，流感病毒B型只偶尔引起疾 病，所以我们重点研究流感病毒A型口蹄疫病毒FMDV是偶蹄类动物高度传染性疾病-口蹄疫的病原，口蹄疫病毒其大小只 有20-25纳米。它由一条单链正链RNA和包裹于周围的蛋白质组成，蛋白质决定了病毒的 抗原性、免疫性和血清学反应能力；病毒外壳为对称的20面体。它有7个血清型(A，0,C，南 非l,南非2,南非3和亚洲1型)，下属60多个亚型，各型间几本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种喷雾剂，其特征在于，含有根据病毒基因组高保守序列设计的小分子干扰核糖核酸。

【技术特征摘要】
CN 2006-6-13 20061008722501. 一种喷雾剂，其特征在于，含有根据病毒基因组高保守序列设计的小分子干扰核糖核酸。2、 如权利要求l所述的喷雾剂，其特征在于所述的病毒为口蹄疫 病毒或流感病毒。3、 如权利要求l所述的喷雾剂，其特征在于所述的小分子干扰核 糖核酸为siRNA， shRNA和microRNA中的一种或多种，且他们的靶序 列不同。4、 如权利要求3所述的喷雾剂，其特征在于所述的小分子干扰核 糖核酸选自表3所示的siRNA、 shRNA和microRNA中的 一种或多种， 且他们的靶序列不同。5、 如权利要求1 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝加贝，
申请(专利权)人：祝加贝，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]