脱氧核糖核酸分子的通用捕集法制造技术

本发明专利技术涉及一种脱氧核糖核酸分子的通用捕集法，可应用于分子医学的疾病诊断。本方法包括预杂交、杂交、洗板、酶联、洗板、显色、光密度测定等步骤，利用接头液分子的特异性部分与病原体核酸分子的杂交及通用部分与共价键地固定在通用捕集孔上的通用捕集寡核苷酸分子杂交而应用于临床检测。该法与直接法相比较，具有杂交特异性强、杂交效率一致、灵敏度高、操作方便、能做定性定量及分型等多种检测、临检效率高、成本费用低等特点，适合日益增多的临检需要。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种脱氧核糖核酸分子的通用捕集法，俗称DNA探针—通用捕集法，可应用于分子医学的疾病诊断。近年来以核酸为基础的分子诊断技术(简称“DNA探针”)在国际上发展很快，逐步将成为临床检验中的常规手段。“DNA探针”是赖于核酸互补顺序的特导性杂交来判别结果的，利用这个原则，在分子生物学领域中曾提出了“Soutnern吸印法”、“Northern吸印法”及斑点杂交法等，这些方法的特异性还是靠核酸杂交技术来确定被测的脱氧核糖核酸分子顺序以达到诊断疾病的目的。国际公认的临检多聚酶链锁式反应(简称PCR)检测法，必须包括“探针杂交”这样一个步骤。九十年代初，罗氏公司(Roche)首先专利技术了“直接捕集法(Capture)”，以代替难以被临床接受的“Southern吸印法”，并广泛地被有酶标板(ELISA板)基础的临检实验室接受，至今在北美、西欧和日本普遍被采用的AmPLicor(罗氏公司PCR试剂盒的商标)仍属“直接捕集法”。但是此法每种板只能测定一种病原体，成本费用高、特异性较差、操作不便、杂交效率不一致等，与日益增多的临检要求不相适应。本专利技术的目的是在直接捕集法的基础上加以改进而提供一种脱氧核糖核酸分子的通用捕集法，具有杂交特异性强，灵敏度高，杂交效率一致、临检准确、生产成本低、适用于定性、定量或分型等检测、医学诊断可靠等特点。本专利技术的目的是这样实现的一种脱氧核糖核酸分子的通用捕集法，包括下列步骤A)预杂交取12.5微升的1.6毫微克/微升接头分子液加入到盛有100微升杂交液的通用捕集孔中，37℃保温1小时，进行预杂交反应形成通用捕集杂交链，然后弃去孔中剩余液；B)杂交取100微升杂交液加入到上述孔中，取待测的生物样品40微升PCR反应液与40微升变性液的混合液25微升加到上述孔中，37℃保温1小时进行杂交链反应；C)洗板用洗涤液对孔中反应产物进行洗涤5次，每次用量300微升，然后弃去洗涤液；D)酶联取50毫微克/毫升的酶联液100微升加入到上述孔中，37℃保温15分钟进行酶联反应；E)洗板用洗涤液对孔中反应产物进行洗涤5次，每次用量300微升，然后弃去洗涤液；F)显色加入显色液100微升，25℃保持10分钟后加入停显液100微升；G)测定上述样品移至在波长450毫微米的酶标仪上测定光密度数；H)判别测得光密度数与内对照物光密度数参比，判别检测结果。本专利技术中所述的生物样品为抽取的血样经国际公认的临检多聚酶链锁式反应(简称PCR)后的产物；接头液分子为a)乙型肝炎病毒接头分子液；或b)丙型肝炎病毒接头分子液；或c)丙种球蛋白接头分子液；或d)爱滋病毒接头分子液；或e)结核菌接头分子液；或f)沙眼衣原体接头分子液；或其它病原体接头分子液，其接头液分子的结构为一条单链的寡核苷酸，分为由长25个碱基的通用部分、长5到4毫微米的“空间”部分及约为22～26个碱基的特异性部分构成，其特异性部分为只能与带有乙型肝炎病毒PCR产物起杂交反应的乙型肝炎病毒特异性顺序、或与带有丙型肝炎病毒PCR产物起杂交反应的丙型肝炎病毒特异性顺序、或与带有丙种球蛋白PCR产物起杂交反应的丙种球蛋白特导性顺序、或与带有爱滋病毒PCR产物起杂交反应的爱滋病毒特异性顺序、或与带有结核菌PCR产物起杂交反应的结核菌特异性顺序、或与带有沙眼衣原体PCR产物起杂交反应的沙眼衣原体特异性顺序或与任一种待测的特异性顺序；通用捕集孔为具有活性基团的聚苯乙烯微孔板，其活性基团与接头液分子的通用部分(即通用捕集探针)的互补寡核苷酸共价键地联接固定；杂交液为0.9MNacl柠蒙酸缓冲液，使变性后的PCR产物或接头分子液加入孔中后杂交反应的PH值维持在最适范围内，它的离子浓度和保持温度恰好与形成的二种杂交链(即通用杂交链和特异性杂交链)的Tm(融点温度)配合而使杂交效率维特在一个稳定的水平上；变性液为0.2MNaOH溶液；洗涤液为0.15MNacl溶液，其盐浓度对维护杂交链起了保护作用，有效地洗去非特异性的吸附，保证了杂交反应的特异性；酶联液为过氧化物酶和亲和素的交联物；显色液为四甲基联苯胺与过氧化氢重量比1∶1的混合液；停显液为5％硫酸溶液。本专利技术中所述的试剂、仪器均由国内生产厂家销售，如上海生工生物工程公司、上海浩源生物科技有限公司及化工化学试剂商店。本专利技术与现有技术相比，具有杂交特异性强、操作方便、杂交效率一致、适用于定量聚合酶链锁式反应(PCR)、易于生产、价格较便宜等特点。下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1取12.5微升的1.6毫微克/微升带有乙型肝炎病毒特异性顺序的接头分子液加入到盛有100微升0.9MNacl柠蒙酸缓冲液的通用捕集孔中，37℃保温1小时进行预杂交，然后弃去孔中剩余液，再加入100微升0.9MNacl柠蒙酸缓冲液，取生物样品乙型肝炎病毒PCR的反应液40微升与40微升0.2MNaoH变性液的混合液25微升加入上述孔中，37℃保温1小时进行杂交，接着用0.15MNacl洗涤液洗涤孔中产物，洗涤5次，每次用量300微升，洗涤后弃去洗涤液，接着加入100微升过氧化物酶酶联液，37℃保温15分钟进行酶联反应，再用0.15MNacl溶液洗涤孔中产物5次，每次300微升，弃去洗涤液后，加入显色液100微升，25℃保持10分钟后加入5％硫酸停显液100微升，样品在波长450毫微米的酶标仪上测定光密度数，4次重复结果为1.123，1.061、1.139、0.932。实施例2生物样品为爱滋病毒PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.044，0.043，0.058，0.043。实施例3接头液分子的特异性部分为丙型肝炎病毒顺序，生物样品为丙型肝炎病毒PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.929，0.967，0.975，0.844。实施例4接头液分子的特异性部分为丙型肝炎病毒顺序，生物样品为丙种球蛋白PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.047，0.042，0.035，0.044。实施例5接头液分子的特异性部分为丙种球蛋白顺序，生物样品为丙种球蛋白PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得的光密度数为1.228，1.066，1.141，1.309。实施例6接头液分子的特异性部分为丙种球蛋白顺序，生物样品为乙型肝炎病毒PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.040，0.044，0.064，0.061。实施例7接头液分子的特异性部分为爱滋病毒顺序，生物样品为爱滋病毒的PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.946，0.947，0.927，1.086。实施例8接头液分子的特异性部分为爱滋病毒顺序，生物样品为丙型肝炎病毒PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.047，0.048，0.044，0.043。实施例9接头液分子的特异性部分为结核菌顺序，，生物样品为结核菌PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.869，0.734，0.748，0.772。实施例10接头液分子的特异性部分为沙眼衣原体顺序，生物样品为沙眼衣原体PCR产物，其余同实施例1，重复4次测得光密度数为0.945，0.883，1.058，0.980。实施例11接头液分子的特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脱氧核糖核酸分子的通用捕集法，其特征在于：包括下列操作步骤：Ａ）预杂交：取１２．５微升的１．６毫微克／微升接头分子液加入到盛有１００微升杂交液的通用捕集孔中，３７℃保温１小时，进行预杂交反应形成通用捕集杂交链，然后弃去孔中剩余液； Ｂ）杂交：取１００微升杂交液加入到上述孔中，取待测的生物样品４０微升ＰＣＲ反应液与４０微升变性液的混合液２５微升加到上述孔中，３７℃保温１小时进行杂交链反应；Ｃ）洗板：用洗涤液对孔中反应产物进行洗涤５次，每次用量３００微升，然后弃去洗 涤液；Ｄ）酶联：取５０毫微克／毫升的酶联液１００微升加入到上述孔中，３７℃保温１５分钟进行酶联反应；Ｅ）洗板：用洗涤液对孔中反应产物进行洗涤５次，每次用量３００微升，然后弃去洗涤液；Ｆ）显色：孔中加入显色液１００微升，２５℃保持 １０分钟后加入停显液１００微升；Ｇ）测定：上述样品移至在波长４５０毫微米的酶标仪上测定光密度数。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄道培，
申请(专利权)人：黄道培，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]