本发明专利技术公开了一种具有核糖核酸酶活性的蛋白质及其制备方法与应用。本发明专利技术证明一种植物PR-10蛋白为具有体外切割单链RNA和双链RNA活性的核酸酶，该植物PR-10蛋白的下述用途属于本发明专利技术的保护范围：C1、蛋白质在作为核糖核酸酶中的应用或在制备核糖核酸酶产品中的应用；C2、所述蛋白质的相关生物材料在制备核糖核酸酶产品中的应用。本发明专利技术所提供的蛋白质的制备方法，包括下述步骤1)和2)：1)制备表达所述蛋白质的重组生物细胞；2)表达所述重组生物细胞，得到所述蛋白质。实验证明，本发明专利技术提供的蛋白质的制备方法具有较强的实用性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中一种具有核糖核酸酶活性的蛋白质及其制备方法与应用。
技术介绍
核糖核酸酶(Ribonuclease，RNase)的全名为聚合苷-α-寡核苷酸转移酶，是一类广泛存在于动植物体内的核酸水解酶。它对于调节RNA的代谢、转录后基因表达调控和抵御病毒侵染等起到重要作用(Court DL.et al.,2013)。已经报道的核酸酶种类很多，例如研究中常用的RNase A对RNA有水解作用，可以用来消化DNA制品中的RNA；依赖于2-5A系统的RNase L可以特异性降解单链RNA(Zhou A et al.,1993),来源于大肠杆菌的RNaseIII、酵母的Rnt1p和PacI以及植物的Dicer等RNaseIII家族酶具有特异切割双链RNA的核糖核酸酶活性(Court DL.et al.,2013)。研究发现新型RNase对于认识生物体生长发育调控和应用具有重要意义。病程相关蛋白(Pathogenesis-related protein，PR)是由寄主植物编码的、多种病原物以及化学药品或类似的胁迫而诱导表达积累的一类蛋白。PR蛋白现今有17个家族(Liu and Ekramoddoullah,2006)。在整个PR蛋白家族中，只有PR-10被推测具有防御病毒的功能。PR-10蛋白在种子植物中以多基因家族形式存在，是受发育和环境调控的。在双子叶植物中，PR-10在欧芹、豌豆、土豆、菜豆、大豆、芹菜和苜蓿中都有报道；在单子叶植物中，芦笋、水稻、百合、高粱中也都有发现；在糖松，北美乔松，西部白松，花旗松，海岸松，白云杉，山毛榉，桦树，桐油树这些树种中，也都发现了PR-10蛋白(Agarwal and Agarwal,2013)。不同来源的PR-10功能可能存在差异。一些PR-10蛋白，如CsPR10-1、TcPR-10、AhPR-10、JcPR-10和SsPR-10都具有抗真菌和RNase活性，而来自桦树、羽扇豆和棉属植物中的PR-10只有RNase活性。Park等人报道了CaPR-10蛋白RNase活性和抗病毒活性之间的关系(Park et al.,2004)。AhPR-10突变体蛋白被尖孢镰刀菌(F.oxysporum)内吞实验中，RNase活性域与真菌膜能够互作；变性的TcPR-10和JcPR-10a会丧失RNase活性和抗真菌活性(Chadha and Das,2006；Pungartnik et al.,2009；Agarwal et al.,2013)。但尚无具有体外切割双链RNA(dsRNA)活性植物PR-10的正式报道。在申请人前期研究发现含有RNA4组分的甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)侵染本生烟可以诱导一种本生烟编码PR-10蛋白(NbPR-10)的mRNA急剧升高(Wu et al.,2014)的基础上，利用基因工程技术建立一种NbPR-10蛋白制备方法，证明体外具有切割单链和双链RNA的活性,其中体外具有切割双链RNA活性的PR-10尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种具有切割单链RNA和双链RNA活性的蛋白质及其制备方法与应用。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了如下C1或C2的应用：C1、蛋白质在作为核糖核酸酶中的应用或在制备核糖核酸酶产品中的应用；C2、所述蛋白质的相关生物材料在制备核糖核酸酶产品中的应用；所述蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有核糖核酸酶活性的蛋白质。其中，SEQ ID No.2由160个氨基酸残基组成，是核糖核酸酶NbPR-10的氨基酸序列。为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID No.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签或GST标签(如pGEX-KG中携带的GST标签)。上述b)具体可为在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接GST标签得到的融合蛋白。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。与蛋白质NbPR-10的相关生物材料也属于本专利技术的保护范围。本专利技术所提供的与蛋白质NbPR-10的相关生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：B1)编码蛋白质NbPR-10的核酸分子；B2)包含B1)所述核酸分子的表达盒；B3)包含B1)所述核酸分子的重组载体、或包含B2)所述表达盒的重组载体；B4)包含B1)所述核酸分子的重组微生物、或包含B2)所述表达盒的重组微生物、或包含B3)所述重组载体的重组微生物；B5)包含B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或包含B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或包含B3)所述重组载体的转基因植物或动物细胞系。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述生物材料中，B1)所述核酸分子具体可为如下1)或2)或3)或4)所示的核酸分子：1)编码序列是SEQ ID No.1的第1-483位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；2)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子或cDNA分子；3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。其中，SEQ ID No.1由483个核苷酸组成，SEQ ID N本文档来自技高网...
【技术保护点】
C1或C2的应用：C1、蛋白质在作为核糖核酸酶中的应用或在制备核糖核酸酶产品中的应用；C2、所述蛋白质的相关生物材料在制备核糖核酸酶产品中的应用；所述蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有核糖核酸酶活性的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.C1或C2的应用：
C1、蛋白质在作为核糖核酸酶中的应用或在制备核糖核酸酶产品中的应用；
C2、所述蛋白质的相关生物材料在制备核糖核酸酶产品中的应用；
所述蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；
b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有核糖核酸酶活性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质的相关生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)包含B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)包含B1)所述核酸分子的重组载体、或包含B2)所述表达盒的重组载体；
B4)包含B1)所述核酸分子的重组微生物、或包含B2)所述表达盒的重组微生物、或包含B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)包含B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或包含B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或包含B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：
1)其编码序列是SEQ ID No.1的第1-483位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；
2)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子或cDNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子或cDNA分...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩成贵，武文琦，王颖，姜宁，范慧艳，李大伟，于嘉林，张超，王献兵，张宗英，张永亮，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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