尖吻蝮蛇血凝酶‑C制造技术

本发明专利技术提供了一种尖吻蝮蛇血凝酶‑C，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到的一种血凝酶，分子量29213.4D，等电点5.7。该酶由α、β两条链构成，链间由二硫键连接，其中α链具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，β链具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明专利技术尖吻蝮蛇血凝酶为丝氨酸蛋白酶。本发明专利技术丝氨酸蛋白酶是用以下纯化方法获得，包括通过硫酸铵分级沉淀预处理去除不溶物及杂蛋白，再通过两次阴离子交换柱层析，收集活性洗脱峰，经透析、超滤浓缩及脱盐后即得高纯度蛇毒血凝酶，其比活力不低于40U/mg蛋白，HPLC分析纯度可达95%以上，以蛇毒原料重量计纯化收得率为0.4%－0.5%。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是下述专利技术的分案申请：申请日：2013年02月21日 ；申请号：201310055128.3；专利技术名称：尖吻蝮蛇血凝酶–C。
本专利技术涉及一种丝氨酸蛋白酶，具体地说是一种蛇毒血凝酶-C，本专利技术还涉及其分离纯化方法。
技术介绍
据国内外文献的报导，在蝮亚科（Crotalinae）蛇毒中多存在一类与血液凝固相关的蛋白酶，通常称之为“类凝血酶”（thrombin-like enzyme, 简称：TLC）。类凝血酶与凝血酶（thrombin）的作用相似，可以使血浆中纤维蛋白原转化为纤维蛋白而“凝固”。迄今已经发现现已在30多种蛇毒中含有类凝血酶成分，并有20余种得到分离纯化，其中有10余种类凝血酶的全部或部分氨基酸序列得到阐明。已发现的TLC分子量多在29～45kD之间，大多数为酸性糖蛋白。在以往已经发现的蛇毒TLC中，蛋白质一级结构多为单链。其代表产品“立芷雪”（Reptilase）是由巴西矛头蝮蛇（Bothrops atrox）蛇毒中分离出的凝血酶，该酶前体由255个氨基酸构成，N端有24个氨基酸形成的引导肽，活性酶含231氨基酸，相对分子量39～43kD，为单链糖蛋白。翟宁等（上海医药工业研究院&浙江海正药业）2005年报道：从皖南五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到一种“类凝血酶”，具有凝血作用。SDS－PAGE显示为单链，还原和非还原电泳分子量分别为59.25kD和52.58kD，显示存在链内二硫键，比活为41.5/u/mg，苯甲基磺酰氟（PMSF）可导致该酶不可逆失活。近十多年来的研究发现在蝮亚科蛇毒TLC中也存在双链分子结构，链间由二硫键连接。Xin Cheng等（中国科技大学）1999年报导：从五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到一种“类凝血酶”，命名为“Agkisacutacin”。该蛋白由两条肽链构成，α-亚基分子量15kD，β-亚基分子量14kD。Agkisacutacin能够水解纤维蛋白原中的α链。肖昌华（中科院昆明动物研究所）2004年从五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到两种“类凝血酶”，均为双链分子结构。凝血酶Ⅰ的A亚基含有132个氨基酸，分子量16kD；B亚基含有123个氨基酸，分子量14kD，酶比活性为：160U/mg。凝血酶Ⅱ的A亚基含有122个氨基酸，分子量15kD；B亚基含有120个氨基酸，分子量13kD, 酶比活性为：70U/mg。该两种TLC经药理实验证明：均具有止血功效。唐松山2004年从五步蛇（Agkistrodon acutus）中分离到一种“类凝血酶”，具有凝血作用。该酶由17kD和15kD两个亚基组成，等电点5.9。本专利技术阐述从我国的广西尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutu)蛇毒中分离得到一种新的蛇毒血凝酶――尖吻蝮蛇血凝酶-C。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蛇毒血凝酶，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到的一种类凝血酶-C。本专利技术的另一个目的在于提供一种分离纯化上述血凝酶的方法。本专利技术血凝酶-C是从中国尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）蛇毒中分离得到的血凝酶。该酶具有如下特征：①酶蛋白含252个氨基酸，分子量为29213.4D，等电点pI为5.7。②由α、β两条链构成，链间由二硫键连接。③α链含129个氨基酸，分子量为14661.7D，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；β链含123个氨基酸，分子量为14551.7D，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。④酶活性可被苯甲基磺酰氟（PMSF)完全抑制，表明其是一种丝氨酸蛋白酶。本专利技术还提供上述血凝酶的纯化方法，其包括如下步骤：1）、蛇毒经硫酸铵分级沉淀预处理；2）、将预处理后的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE－Sephrose FF阴离子交换层析柱，用0.01M pH7.0～7.5的PBS洗柱，再用含0.02和0.06M NaCl的0.01M pH7.0～7.5的 PBS分段洗脱，收集0.06M NaCl第一个洗脱峰；3）、将上述洗脱液适当浓缩后透析或经多次稀释超滤去除NaCl；4）、将透析后的溶液再次上经预平衡的DEAE－Sephrose FF层析柱，用0.01M pH7.0～7.5 的PBS洗柱，再用含0.05M NaCl的0.01M pH7.0～7.5 的PBS洗脱，收集0.05M NaCl洗脱的第二个洗脱峰；5）、将上述洗脱液适当浓缩后用蒸馏水透析或采用Sephadex-G25柱脱盐。其中，步骤1）蛇毒预处理的方法是将蛇毒用适量预冷的0.01M pH7.0～7.5 PBS溶解，离心收集上清液，硫酸铵分级沉淀，收集70%硫酸铵沉淀，沉淀经PBS悬浮溶解后进行透析(透析袋截留分子量为7,000D~10,000D)，或采用切向流超滤（膜截留分子量为5,000D～10,000D）方法，将悬浮溶解液反复多次稀释、超滤浓缩脱盐。通过预处理可以去除不溶的杂质以及部分杂蛋白，并降低溶液离子强度。具体地说，可通过如下步骤进行蛇毒的预处理：称取蛇毒若干克，用蛇毒重量5~10倍体积预冷的0.01M pH7.0～7.5 的PBS于4~8℃的层析柜中搅拌溶解30~60分钟，向溶解液中缓慢添加硫酸铵至50％饱和度，静置2－4小时，之后于4~8℃、5,000~10,000g离心10~30分钟。收集离心上清液，再向离心上清液中缓慢加入硫酸铵至70％饱和度，静置过夜，次日于4~8℃、5,000~10,000g离心10~30分钟。取离心沉淀加适量0.01M pH7.0～7.5的PBS悬浮溶解得溶解液。将溶解液倾入透析袋(截留分子量为7,000D~10,000D)，在层析柜中4~8℃对0.01M pH7.0～7.5的 PBS透析12~24小时，期间更换溶液2~4次；或将溶解液用分子截留值为5,000~10,000D的超滤膜经反复多次加入PBS进行稀释超滤浓缩脱盐。如上所述，透析步骤（取决于溶液体积）可采用切向流超滤（膜截留分子量为5,000~10000D）方法代替，通过PBS稀释、超滤浓缩，再稀释、再超滤浓缩的方式以去除小分子多肽和脱盐降低溶液离子强度。其中，步骤2）和步骤4）可采用0.01M pH7.0～7.5 的PBS预平衡DEAE－Sephrose FF层析柱，然后上样。其中，步骤3）和步骤5）的目的均是去除溶液中存在的NaCl。小体积洗脱液可直接进行透析，大体积洗脱液可通过PBS稀释、超滤浓缩，再稀释、再超滤浓缩的方式以浓缩蛋白并脱去NaCl。最终被纯化的酶浓缩液可直接采用Sephadex-G25柱脱盐。除盐后的溶液直接冷冻干燥，或加入冻干保护剂冷冻干燥。所述冻干保护剂可以是低分子右旋糖酐、甘露醇、蔗糖、甘油、明胶等。不同冷冻保护剂的各自加入量为0.1%－2%(w/v)。经本专利技术方法纯化的血凝酶比活力不低于40U/mg蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）一条带，还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（还原SDS-PAGE）本文档来自技高网...

【技术保护点】
蝮蛇血凝酶‑C，该酶由α、β两个亚基构成，其中α亚基具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；β亚基具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
2012.12.28 CN 20121058553311.蝮蛇血凝酶-C，该酶由α、β两个亚基构成，其中α亚基具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；β亚基具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的尖吻蝮蛇血凝酶-C，其分子量为29213.4D，等电点pI为5.7，分离自中国尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）。
3.权利要求1所述的尖吻蝮蛇血凝酶-C，其通过以下纯化方法获得：
1）、将中国尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）蛇毒经硫酸铵分级沉淀预处理；
2）、将预处理后的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE－Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，用0.01M pH7.0～...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙狄，王锡娟，
申请(专利权)人：北京康辰药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11