本发明专利技术公开了一种尖吻蝮蛇血凝酶的制备方法与用途。它包括溶解蛇毒、低温离心、透析、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ层析、透析、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ层析及Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５层析步骤。它从中国特有的尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化得到的尖吻蝮蛇血凝酶，是由Ａ和Ｂ两个亚基组成，具有促进血液凝固和止血作用。Ａ和Ｂ两个亚基的分子量为１５．０ＫＤ和１４．２ＫＤ。Ａ亚基Ｎ端第一至２５位的氨基酸序列为ＤＣＳＳＧＷＳＳＹＥＧＨＣＹＫＶＦＫＱＳＫＴＷＴＡ，Ｂ亚基Ｎ端第一至２５位的氨基酸序列为ＤＣＰＳＤＷＳＳＹＥＣＨＣＹＫＰＤＥＰＫＴＷＥＤＡ。尖吻蝮蛇血凝酶可用于临床上人的各种类型出血的止血。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种尖吻蝮蛇血凝酶制备方法与用途。特别是指一种从中国特产的尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化的具有止血作用的蛇毒类凝血酶的制备方法。
技术介绍
蛇毒类凝血酶(Thrombin-like enzymes，TLEs)是从蛇毒中分离提纯的一类具有凝血酶样活性的蛋白酶，能直接特异性地水解纤维蛋白原形成纤维蛋白而促使血液凝固。在国外和国内已批准生产的用于止血的类凝血酶制剂主要是立止血，是从洞蝮蛇(Bothrops Atrox)蛇毒纯化出的类凝血酶。由瑞士巴塞素高大药厂研制的商品名“立止血”(Reptilase)的止血药物，就是从巴西独有的洞蝮蛇毒中提炼的类凝血酶，我国每年从瑞士进口数百万支立止血在临床上广泛的应用。我国至今还没有类似的药物能替代立止血。立止血是一种分子量约为42000Da的蛋白质，其止血作用的机理是在血液中可水解纤维蛋白原的A-链，由此形成的纤维蛋白I单体可进一步聚合成复合物。与纤维蛋白原相比，这种纤维蛋白I单体及其复合物更易受到凝血酶和纤溶酶的作用，同时也易粘附于血管的破损部位。因此，在血管损伤的局部，由于凝血酶的浓度较高，可迅速将纤维蛋白I单体的B-链水解去除，交联形成生理性的纤维蛋白凝块而产生止血作用，而在循环中的纤维蛋白I则可被纤溶酶清除。但是立止血是从巴西洞蝮蛇蛇毒中分离纯化的止血药物，在我国没有该蛇种的分布(具文献中国大药房，1996，7(3)137)。尖吻蝮蛇是我国华南地区常见的蛇种，蛇毒来源丰富，并含有丰富的TLEs。对于尖吻蝮蛇蛇毒的TLEs，台湾学者Ouyang，C.和Cheng，H.C.等，以及中国科技大学等单位曾进行了大量的研究，但均未见动物体内外止血作用的研究报道，分离的TLEs也与目前临床使用的降纤酶性质大多类似。肖昌华等学者曾报道尖吻蛇毒至少有四种TLEs组分，其中有两种TLEs在动物体内有促凝止血作用。管锦霞等学者也曾报道尖吻蝮蛇蛇毒的组分可缩短动物的凝血时间，但未见进一步开发研究的报道。魏文莉、孙家钧等学者曾尝试利用尖吻蝮蛇蛇毒和蝮蛇毒的TLEs用于动物的体外局部止血，但这些学者所用的尖吻蛇毒TLEs至少有四种，并含有其他杂蛋白，其实验设计的目的主要是想利用尖吻蛇毒TLEs和蝮蛇毒TLEs对纤维蛋白原Aα链和Bβ链不同的水解特点，形成一种更为接近生理状态的凝块，在出血的局部进行止血，但并未证明这些TLEs本身单独使用时有止血作用。综合国内研究的报道，目前尚没有我国自主研究的类似立止血这样的类凝血酶作为止血药批准用于临床。目前文献报道的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的分离纯化一般均采用阴离子交换层析和分子筛层析方法进行。采用这种工艺方法，生产周期长、收率低、纯度较差。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于避免上述现有技术中的不足，而提出一种新的尖吻蝮蛇血凝酶的制备方法与用途。本专利技术所提供的生产一种尖吻蝮蛇血凝酶的制备方法，该方法包括以下步骤A.尖吻蝮蛇粗毒用磷酸缓冲液溶解离心，透析，经DEAE-Sepharose层析，不同溶液的NaCl溶液梯度洗脱，收集得到组分。B.再透析在经DEAE-Sepharose层析，得到精制的纯度尖吻蝮蛇血凝酶。C.收精制的尖吻蝮蛇血凝酶，经Sephadex625层析柱脱盐后，得到尖吻蝮蛇血凝酶原料药。D.收所得的尖吻蝮蛇血凝酶原料药加赋形剂过滤、分装和冷冻干燥，制得注射用尖吻蝮蛇血凝酶。一种从中国特有的尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化得到的尖吻蝮蛇血凝酶，是由A和B两个亚基组成，具有促进血液凝固和止血作用。进一步地，尖吻蝮蛇血凝酶A和B两个亚基的分子量为15.0KD和14.2KD。A亚基N端第一至25位的氨基酸序列为DCSSGWSSYEGHCYKVFKQSKTWTA，B亚基N端第一至25位的氨基酸序列为DCPSDWSSYECHCYKPDEPKTWEDA。进一步地，尖吻蝮蛇血凝酶具有的止血作用是指该酶可用于哺乳动物出血的止血以及临床上人的各种类型出血的止血。一种在临床上具有止血功能的药物组合物，该药物组合物含具有止血作用的尖吻蝮蛇血凝酶。进一步地，在临床上具有止血功能的药物组合物，除含有具有止血作用的尖吻蝮蛇血凝酶外，还含有药学上可接受载体和/或赋形剂。本专利技术有如下优点1、本专利技术的制备工艺是生产周期短、原料药收率高、纯度好的大批量制备工艺。原料药的收率约0.5％，纯度在95％以上。2、尖吻蝮蛇血凝酶是从中国特有的尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化的双亚基类血凝酶，生产成本低，符合中国国情。3、按上述方法所制备的尖吻蝮蛇血凝酶特点如下第一，尖吻蝮蛇血凝酶作为一种新的止血药，具有止血作用强，毒性极低的优点。从目前动物和人体I期、II期、III期临床研究结果来看，尚没有观察到尖吻蝮蛇血凝酶有明显的毒性作用。第二，经飞行质谱测定，该酶分子量约为29300-29500Dalton，分别由约15.0KD和16.2KD的两条多肽链以二硫键连接而成的糖蛋白，含204个氨基酸。动物试验表明，该酶能缩短凝血时间，具有很好的止血作用，其作用机理也是通过水解纤维蛋白原的A-链，形成纤维蛋白而起到止血作用。更重要的是该酶毒性非常低，急性毒性实验中测不出LD50。经过结构确证理化性质和酶学特性等的研究证明，立止血为单链，尖吻蝮蛇血凝酶是一种完全不同于立止血的类凝血酶，是一种全新的蛋白类止血药物。尖吻蝮蛇血凝酶与立止血的比较 上述尖吻蝮蛇血凝酶与立止血的比较表明，尖吻蝮蛇血凝酶是一种结构完全不同于立止血，但具有止血作用的新的蛇毒类凝血酶。该产品仅具有止血功能，并不影响血液中的凝血酶原数量和血小板数量，在正常血管内没有血小板凝聚作用，因此无血栓形成危险。尖吻蝮蛇血凝酶是经过分离和提取的凝血酶，纯度为95％以上，不含神经毒素和其它毒素。其毒理学研究显示，该产品是一种安全的止血药物。经药学、药效学、毒理学、药代动力学的研究表明，本专利技术涉及的尖吻蝮蛇血凝酶具有毒性小、有显著的促进凝血作用和止血作用，适用于临床上各种类型的出血性疾病的预防和治疗。附图说明图1为本专利技术的生产工艺流程图。具体实施例方式下面结合附图说明本专利技术的具体实施方式。本专利技术的技术方案是首先从中国特有的尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化的纯度大于97％以上，分子量为29.2KD的尖吻蝮蛇血凝酶，并确定结构特征为A亚基N端第一至25位的氨基酸序列为DCSSGWSSYEGHCYKVFKQSKTWTA，B亚基N端第一至25位的氨基酸序列为DCPSDWSSYECHCYKPDEPKTWEDA。并采用药效学实验证明具有止血功能。如图1所示1.粗毒样品的处理称取蛇毒30g，溶于200ml 0.01M磷酸缓冲液(pH7.4)，5000rpm×30min在4℃离心，上清液倒入透析袋(截留分子量为8000-10,000)内，在4℃冰箱内，置于同样的缓冲液中透析24小时，其中提透析液两次。2.DEAE-Sepharose FF层析层析柱(3.6×40cm3)用0.01M磷酸缓冲液(PH7.4)充分平衡，透析后的蛇毒用恒流泵以15ml/min的速度注入柱内。上样完毕，用含0.02M NaCl的上述磷酸缓冲液洗脱，洗脱至体积约3100ml后，用0.02-0.1M NaCl的上述磷酸缓冲液进行直线梯度洗脱，流速约20ml/min，记录并收集蛋白洗脱峰。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种尖吻蝮蛇血凝酶的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：Ａ．尖吻蝮蛇粗毒用磷酸缓冲液溶解离心，透析，经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ层析，不同溶液的ＮａＣｌ溶液梯度洗脱，收集得到组分；Ｂ．再透析在经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒ ｏｓｅ层析，得到精制的纯度尖吻蝮蛇血凝酶；Ｃ．收精制的尖吻蝮蛇血凝酶，经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５层析柱脱盐后，得到尖吻蝮蛇血凝酶原料药；Ｄ．收所得的尖吻蝮蛇血凝酶原料药加赋形剂过滤、分装和冷冻干燥，制得注射用尖吻蝮蛇血凝酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王锡娟，
申请(专利权)人：康辰医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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