【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】Na/K-ATP酶配体、毒毛花苷G拮抗剂及其测试方法和用途专利技术人:Zi-Jian Xie, Shuyi Si, Zhongbing Zhang, Joseph I. Shapiro与相关申请的交叉引用本申请要求2009年9月16日提交的美国临时申请号61/243，036的权益，通过援引将其公开内容并入本文。有关联邦赞助研究的声明本专利技术通过政府支持而进行，由此政府根据National Institutes ofHealth (NIH)GM78565, HL366573 和 2007DFA31370 对本专利技术具有权益。本专利技术的
和工业应用本专利技术涉及Na/K-ATP酶配体及其用途。本专利技术也涉及用于筛选物质的Na/K-ATP酶激动剂和/或拮抗剂活性的方法和试剂盒以及用通过本文描述的筛选方法鉴定的物质来治疗或预防疾病或障碍的方法和试剂盒。
技术介绍
Na/K-ATP酶，也称为钠泵，是通过水解ATP将Na+和K+跨过质膜运输的普遍存在的跨膜酶。其属于P-类型ATP酶家族，其在泵循环期间在El和E2构象状态之间转换。该功能酶主要由α和β亚单位构成。α亚单...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.09.16 US 61/243,036中所定义的本发明范围，除非另外指定。实施例I材料ATP禾口毒毛花苷 G 得自 Sigma (St. Louis，MO)。BIOMOL GREEN 购自 BIOMOL(Plymouth Meeting, PA)。 ERK/MAPK(磷酸 _Thr202/Tyr204)磷酸化 / 转位细胞型测试试剂盒购自Cayman化学公司(Ann Arbor, MI)。纯化的重组Src得自 Upstate Biotechnology (Lake Placid，NY)。多克隆抗-Tyr(P)418-Src 得自 Invitrogen (Camarillo, CA) oifi-c-Src (B-12)单克隆抗体来自 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA) 0普通化学品为可获得的最高纯度。新鲜猪肾购自附近的屠宰场，并储存在_80°C直至用于制备酶。高通量筛选测试本研究中用于筛选的化学库含有沈00种结构不同的、类药 (drug-like)的天然有机化合物或者它们的半合成衍生物。在96-孔板中以10mg/ml DMSO 溶液制备储备化合物。纯化的Na/K-ATP酶制备自猪肾。各种肾制备物的Na/K-ATP酶的特异性活性为 900-1, 200μ mol/mg/h，其是大于95%的总ATP酶活性。高通量筛选以96-孔规格进行，其中 100 μ 1 的最终反应体积含有下述组分100mM NaCl, 20mM KCl,lmM MgCl2, ImM EGTA,20mM Tris-HCl (pH 7. 4)和0. 2 μ g的纯化的Na/K-ATP酶。在加入化合物之后，在37°C温育混合物15分钟，加入2mM ATP. Mg混合物引发反应。反应进行15分钟，然后通过加入100 μ 1冰冷的三氯乙酸停止。离心澄清反应混合物，根据生产商的指导用BI0M0L GREEN 试剂测试释放的磷酸。此外，在存在和不存在ImM 毒毛花苷G的情况下测量对照Na/K-ATP酶活性，将其视为100%。另外，5μΜ毒毛花苷G 和0. 的DMSO包括在各板中分别作为阳性对照和媒介物对照。对照实验显示，在上述实验条件下，Na/K-ATP酶催化的ATP水解在温育30分钟内处于线性范围。细胞培养物猪肾上皮细胞(LLC-PK1细胞)和人类肺癌症细胞(A549细胞)得自 ATCC,并且在5% CO2加湿温育器中保持于Dulbecco修饰的fegle培养基(DMEM)中，该培养基中存在10% FBS, 100单元/ml青霉素，和100 μ g/ml链霉素。为了消除血清中各生长因子的混杂效果，在实验之前对细胞进行血清饥饿M小时，除非另有指定。[0049]蛋白质印迹分析将细胞用PBS洗涤，在冰冷的RIPA缓冲剂中溶剂化，该缓冲剂含有Nonidet P-40，1 %脱氧胆酸钠，150mM NaCl, ImM EDTA，ImM苯基甲基磺酰氟，ImM正钒酸钠，ImM NaF，10 μ g/ml 抑肽酶，10 μ g/ml 亮肽素，和 50mM Tris-HCl (pH 7. 4)，如前文描述(13)。然后，通过于14，OOOrpm离心澄清细胞溶解产物，将上清液用于蛋白质测试并且进行蛋白质印迹分析。在SDS-PAGE (50 μ g/道)上分离样品，转移至纤维素膜。在室温下， 在 TBST(Tris-HCl IOmM, NaC1150mM,吐温 20,0. 1% ；pH 8. 0)中，将膜用 3%脱脂奶粉(总 Src和ERK)或者BSA+1%脱脂奶粉(磷酸化Src和ERK)封闭1小时，然后用特异性抗体探测。用ECL试剂盒检测蛋白质信号，并用Bio-Rad GS-670成像密度计定量。用于受体Na/K-ATP酶/Src复合物的活化的测试测试受体Na/K_ATP酶/Src复合物的活性。简言之，将纯化的Src (4. 5U)用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中的2μ g纯化的Na/ K-ATP酶在37°C温育30分钟。然后，将Na/K-ATP酶/Src复合物暴露于毒毛花苷G或MB7， 持续10分钟。加入2mM ATP/Mg2+引发反应，在37°C继续5分钟，加入SDS样品缓冲剂使其停止。通过蛋白质印迹用抗-PW18抗体测量Src的活化。为了载量控制还探测总Src。共焦成像和免疫细胞化学将生长在盖玻片上的LLC-PKl细胞血清饥饿M小时，用MB7或毒毛花苷G处理不同的时间。根据生产商的指导，用可商购ERK/MAPK(磷酸-Thr202/Tyr204)磷酸化/转位细胞型测试试剂盒进行p_ERK的免疫染色。用Leica共焦显微镜检测信号。用Leica共焦软件进行数据分析。数据分析所提供的数据为平均值士S. E.。用学生t检验进行统计学分析，于ρ < 0. 05接受显著性。实施例I的结果Na/K-ATP酶抑制剂的高通量筛选为了筛选Na/K-ATP酶抑制剂的化学库，发明人开发了 96-孔规格的测试方法。如图IA的描述，作为阳性对照，毒毛花苷G产生Na/K-ATP酶的剂量-依赖性抑制。另一方面，在以低于反应体积(数据未显示)的浓度使用的情况下，作为媒介物的 DMSO未显示出对Na/K-ATP酶活性的效果。毒毛花苷G的表观IC5tl约5 μ M，其可与报告值比拟。用相同测试来测试最终浓度10 μ g/ml的全部沈00种化合物。因为多数化合物具有约200的分子量，从而调节得到该浓度，使它们在约50 μ M进行测试，其10倍于毒毛花苷G 的IC5(1。在各96-孔板中，将毒毛花苷G (5 μ M)用作阳性对照，而将0. 1 % DMSO用作阴性对照。重复进行测试，产生对Na/K-ATP酶的至少25%抑制的化合物确认为阳性结果。在这些实验条件下，我们发现共15种阳性化合物(下表I)，其包括数种熟知的Na/K-ATP酶抑制剂(杨梅酮、寡霉素、脂蟾毒配基和华蟾蜍毒素。权利要求1. Na/K-ATP酶配体，包含至少一种具有下述结构的羟基咕吨酮衍生物2.权利要求1的Na/K-ATP酶配体，用于抑制Na/K-ATP酶而不活化蛋白激酶。3.权利要求1的Na/K-ATP酶配体，包含MB3，其中R1= OH, R3 = OH和R5 = OH04.权利要求1的Na/K-ATP酶配体，包含MB5，其中R3= OH, R4 = OH和R5 = OH05.权利要求1的Na/K-ATP酶配体，包含MB6，其中R1= OH, R3 = OH, R5 = OH和R6 =OH。6.权利要求1的Na/K-ATP酶配体，包含MB7，其中民=OH,R4 = OH, R5 = OH和& =OH。7.用于抑制Na/K-ATP酶的羟基咕吨酮组合物，包含权利要求1的Na/K-ATP酶配体，其中酚基数量的增多使得所述羟基咕吨酮的效力和效能增加。8.用于抑制Na/K-ATP酶的羟基咕吨酮组合物，包含权利要求1的Na/K-ATP酶配体，其中完全或部分甲基化基本上阻断所述羟基咕吨酮对所述Na/K-ATP酶的抑制效果。9.用于抑制Na/K-ATP酶的羟基咕吨酮组合物，包含权利要求1的Na/K-ATP酶配体，其中在酚基位于吡喃酮环中的氧的附近的情况下，它们对所述化合物的效能更有效果。10.在有需要的细胞中抑制ATP酶活性而不刺激Na/K-ATP酶的受体功能的方法，包括给予有效量的至少一种权利要求1的Na/K-ATP酶配体。11.权利要求11的方法，其中所述Na/K-ATP酶配体包含MB7。12.用于抑制ATP酶活性而不实质上活化受体Na/K-ATP酶/Src复合物的方法，包括给予至少一种权利要求1的Na/K-ATP酶配体。13.Na/K-ATP酶的抑制剂，包含四羟基咕吨酮。14.CTS拮抗剂，包含至少MB5或其衍生物。15.用于筛选Na/K-ATP酶抑制剂的高通量测试方法，包括毒毛花苷G，(5μ M)作为阳性对照以及0. 1% DMSO用作阴性对照，其中鉴定对Na/K-ATP酶产生至少25%的抑制的化合物。16.纯化的Na/K-ATP酶和/或重构的Na/K-ATP酶/Src复合物，用于筛选新...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢子建，J·I·夏皮洛，司书毅，张忠兵，
申请(专利权)人：托莱多大学，
类型：发明
国别省市：
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