尖吻蝮蛇凝血酶用作治疗出血性疾病的药物制造技术

一种尖吻蝮蛇凝血酶用作治疗出血性疾病的药物，该酶是从尖吻蝮蛇（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ａｃｕｔｕｓ）蛇毒中分离纯化的类凝血酶，命名为尖吻蝮蛇凝血酶（Ｈａｅｍｏｃｏａｇｕｌａｓｅ　Ａｃｕｔｕｓ，简写为Ｈａｌａｓｅ），其特征是尖吻蝮蛇凝血酶可用于制备治疗出血性疾病的药物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中分离纯化的类凝血酶，命名为尖吻蝮蛇凝血酶(Haemocoagulase Acutus，简写为Halase)。本专利技术还涉及尖吻蝮蛇凝血酶用于制备治疗出血性疾病的药物的用途。
技术介绍
在临床急救医学中，出血是经常发生的急症。根据出血的原因可将出血分为两大类一种是血液病或出血性疾病，往往是由于机体凝血机能发生障碍而导致的自发性出血。出血性疾病可原发或继发临床各种疾病，如血小板数目减少性紫癜、血友病、再生障碍性贫血、白血病、高血压脑病、消化系统疾病、消化道出血等。另一类是由于受伤或外伤引起的血管组织损伤所致的出血，其发生的原因比出血性疾病简单。无论是出血性疾病或外伤性出血，机体都有一个正常止血过程。一般可分为三期第一期为血管期，主要表现是血管反应性收缩，使血管腔变窄，血流变慢，使出血减少甚至停止。第二期是细胞期，即血小板聚集形成血小板栓子，以达到机械性堵塞血管的初步止血。第三期为血浆期，或血液凝固过程。即在凝血酶的作用下，使纤维蛋白质变成纤维蛋白，将红细胞、白细胞、血小板网络在一起，引起血液凝固，促进或加固止血过程。根据上述正常止血机理过程，按出血的发病机理可将出血的原因分为三种一是血管异常性出血，即由于血管本身的因素，如血管不能闭合，以及毛细血管抵抗力降低或血管周围组织结构异常等引起的出血；二是血小板异常，如血小板生成不足或血小板破坏过多引起的血小板减少；三是凝血机制障碍引起的出血。针对上述引起出血的不同原因，而采取不同的止血方法和措施。临床上常用的止血药物也可据此分为以下三类 第一类是作用于血管壁的止血剂。血管性出血的发病机理主要是血管壁通透性和脆性增高，血管周围的结缔组织松弛，血管的收缩能力下降或损伤因素所致。因此，临床上所用的作用于血管壁的止血剂，一般都是作用于微血管，改善其功能和结构而达到止血作用。第二类是作用于血小板的止血剂，血小板异常引起的出血有以下两种类型一种是血小板功能缺陷性疾病，大多数是先天性的。另一种是血小板减少所致的出血。无论是血小板功能缺陷性或血小板减少性出血，出血严重时，均采用静注血小板悬液来治疗。上述作用于血管壁和血小板的止血药物在临床应用中，其适应性和疗效都有很大的局限性。第三类是作用于凝血过程的止血药物。由于正常凝血过程的复杂性，本类止血药的作用与作用机理比上述两类复杂得多。正常的血液凝固过程简要地说，是在凝血酶的作用下，纤维蛋白原变成纤维蛋白，后者将红细胞、白细胞、血小板网络在一起而引起血液凝固的过程。但另一方面，血液凝固而产生的纤维蛋白网状物必须发生溶解(即纤维蛋白溶解)才能保持血管的通畅，维持血液的流态。这就是血液凝固与纤维蛋白溶解的动态平衡过程。从血液凝固和纤溶蛋白的溶解过程来看，凝血酶和纤溶酶是止血药物作用的关键靶酶，促进凝血酶的活性或具有凝血酶类似作用的类凝血酶都能促进纤维蛋白原变成纤维蛋白，因而具有止血作用；而抑制纤溶酶活性，减少纤维蛋白的降解也具有止血作用。抑制纤溶酶的药物又称抗纤溶药物，在临床上已有广泛应用，主要用于纤溶系统亢进的出血。但由于该类药物有特定的止血机制，需严格掌握适应症，才能收到良好的止血效果。如不加选择地应用，不仅不能收到预期的止血效果，甚至还会发生血栓形成的危险。作用于凝血酶或与凝血酶具有类似作用的类凝血酶是止血药物作用的另一个重要靶酶。已有从人或牛的血浆中直接提取的凝血酶，作为止血药物应用，但凝血酶溶解后的活性不稳定，而且凝血酶静脉注射列为绝对禁忌，因其有引起弥散性血管内凝血的危险性。另外，从蛇毒中提取的类凝血酶具有凝血酶的部分类似活性，但作用和作用特点不同。虽然已从蛇毒中发现多种类凝血酶，但真正在临床取得成功应用的是瑞士素高药厂生产的立止血(Reptilase)，该制品是从蝰科洞蝮蛇属蝮蛇(Bothropsatrox)蛇毒中提取的类凝血酶。在许多国家都已广泛地用于临床，证明是一种高效、速效、安全的止血药物。立止血的作用机理是使纤维蛋白原变成纤维蛋白，纤维蛋白原(Fbg)是由两个相同亚单位组成的糖蛋白，每个亚单位包含三条肽链，即Aα链、Bβ链和γ链。整个纤维蛋白原可用(Aα、Bβ、γ)2表示。立止血的作用机理是水解纤维蛋白原的Aα链，使纤维蛋白原变成纤维蛋白单体。由于立止血对纤维蛋白稳定因子(VIII因子)无激活作用，因而形成的纤维蛋白单体为可溶性纤维蛋白单体。其降解物迅速被体内巨噬细胞系统吞噬、代谢，不引起血栓形成。立止血(Reptilase)的原料是蝰科洞蝮蛇属蝮蛇(Bothrops atrox)蛇毒，但中国没有该蛇的分布。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中分离纯化的类凝血酶，即尖吻蝮蛇凝血酶(Haemocoagulase Acutus，简写为Halase)；以及提供尖吻蝮蛇凝血酶在制备用于治疗出血性疾病的药物中的应用。本专利技术从中国华南地区的尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中分离纯化了一种类凝血酶，命名为尖吻蝮蛇凝血酶(Haemocoagulase Acutus，简写为Halase)。尖吻蝮蛇凝血酶的结构本品是由两个亚基构成的糖蛋白，以二硫键连接。N末端15个氨基酸序列的测定结果如下A亚基DCPSDWSSYE GHCYK；B亚基DCSSGWSSYEGHCYK。分子量29076.1Da，等电点为5.78，含1.89％～1.95％中性已糖。药理和毒理实验结果表明本品具有较强的止血作用，且毒性非常低。尖吻蝮蛇凝血酶是一种与立止血具有相似的止血作用，但结构完全不同的新的止血药物。本专利技术实验证实尖吻蝮蛇凝血酶(Haemocoagulase Acutus，简写为Halase)是从尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中分离纯化的类凝血酶。药理和毒理实验结果表明，本品具有较强的止血作用，且毒性非常低，是一种安全有效的止血药物。本专利技术中，尖吻蝮蛇凝血酶结构确证实验结果如下1.高效液相色谱(HPLC)测定结果尖吻蝮蛇凝血酶呈单一对称峰，纯度＞98％。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)结果尖吻蝮蛇凝血酶为单一区带。3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果尖吻蝮蛇凝血酶由14.8KD和16.0KD两个亚基构成。4.基体辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱分析结果尖吻蝮蛇凝血酶分子量为29076.1Da。5.等电聚焦电泳测定结果尖吻蝮蛇凝血酶的等电点(pI)为5.98。6.N末端15个氨基酸序列的测定结果如下A亚基DCPSDWSSYE GHCYK；B亚基DCSSGWSSYEGHCYK。二个亚基由二硫键连接。本专利技术中，尖吻蝮蛇凝血酶药效学实验结果如下1.尖吻蝮蛇凝血酶对小鼠剪尾出血时间的影响尖吻蝮蛇凝血酶以0.48U/kg、0.24U/kg和0.12U/kg一次静注后30min，小鼠剪尾的平均出血时间分别为32.79±10.55、34.35±11.25和37.52±10.78秒；生理盐水组的平均出血时间为62.44±10.87秒；阳性对照药立止血的平均出血时间为40.90±10.74秒。表明尖吻蝮蛇凝血酶能明显缩短小鼠剪尾出血的时间。2.尖吻蝮蛇凝血酶对兔耳缘静脉出血时间本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴忠，
申请(专利权)人：吴忠，
类型：发明
国别省市：