一种检测ADRB1基因单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测ADRB1基因单核甘酸多态性位点的方法，具体步骤为：1)特异性引物的设计：根据被证实的ADRB1基因标签单核甘酸多态性位点，设计特异性扩增引物、ARMS特异性扩增引物、内标扩增引物、特异性探针、内标探针；其中，所述特异性探针5'端带有荧光基团、3'端带有荧光淬灭基团；2)获得待测样品基因组DNA；3)荧光定量PCR扩增：以待测标本的DNA为模板，用步骤1)所述的特异性扩增引物进行PCR反应，并分析检测结果。该方法灵敏度高、特异性强，操作简便，能在90分钟内完成检测，结果判读方法简单客观，便于分析。

【技术实现步骤摘要】
一种检测ADRB1基因单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种检测ADRB1基因单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒。
技术介绍
高血压等心血管疾病严重威胁人类健康，是50岁以上中老年人的常发疾病，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点。据保守估计，我国高血压患者人数超过了1.6亿，且发病率呈逐年上升趋势。对高血压及其并发症的治疗已经成为全球第三大经济负担。药物是当前和今后相当长的一段时间内治疗高血压及其并发症的主要手段。然而，由于患者的生理状态(如年龄、性别、种族、肥胖、高血压、糖尿病等)、环境危险因素(如吸烟、饮酒)及遗传多态性等导致药物反应(疗效和不良反应)的个体差异，使得接受药物治疗的患者中约有20％-50％病情未得到良好控制。20多年来的遗传药理学研究结果表明其中最重要、最根本的因素是遗传因素，即药物代谢酶、转运体和受体(药物作用靶点)的基因组多态性导致了其编码蛋白的功能改变，进一步使血药浓度和药物敏感型显著不同。β1-肾上腺素受体(β1adrenergicreceptor，ADRB1)是介导儿茶酚胺作用的一类组织受体，为G-蛋白偶联型受体，参与人体对血压的调节，其基因的多态性与高血压密切相关。Ser49Gly和Arg389Gly是ADRB1基因上两个与心血管疾病相关的多态性位点，二者均可在体外及体内改变受体的活性。其中Ser49Gly的多态性与高血压的发病可能没有显著相关性，而Arg389Gly位于细胞内羧基端，影响配体介导的腺苷酸环化酶活性及G蛋白偶联功能，进而影响心率和血压。研究表明，Arg389是高血压的易感基因，基因型为Arg389纯合子的人群更易发展为原发性高血压。ADRB1基因的多态性还与抗高血压药物，尤其是在人体内的反应性密切相关，这里所说的反应性包括了药物的疗效和安全性两个方面，同种剂量的药物作用于拥有不同基因型的患者，有的人恰好有效，有的人根本无效，还有的人会出现药物的毒副反应。美托洛尔和布新洛儿等β-肾上腺素受体阻滞剂(β-阻滞剂)通过阻断交感神经活性，减少去甲肾上腺素的释放，从而降低血压，已被证实能够提高心血管疾病患者的存活率并降低死亡率，是临床上治疗高血压病最常用的一线药物，但是治疗效果受β1-肾上腺素受体(ADRB1)基因多态性的影响因而在不同心血管疾病患者中表现出异质性。心脏在改变β-受体与G蛋白之间分子相互作用中，Arg389比Gly389强3-4倍的信号转导能力，活力更持久，且对激动剂的反应更敏感，因此Arg389Arg基因型高血压患者可能需要更高剂量的β-阻滞剂才能达到与Arg389Gly或Gly389Gly基因型患者相同的治疗效果。Arg389Arg基因型的患者在接受低剂量的β-阻滞剂比高剂量的增加双倍的死亡风险，而Gly389携带者在接受高剂量或低剂量β-阻滞剂时在死亡风险上无明显差异。Gly49对激动剂具有更强的亲和力，在激动剂长期刺激下脱敏效果更明显，Gly49基因型患者对β-受体阻滞剂的抑制作用较Ser49基因型患者更为敏感。因此利用基因检测技术对高血压患者的ADRB1基因多态性进行解读，根据个体与药物治疗相关基因的遗传多样性制定不同的治疗方案，实现药物治疗个体化具有重要的临床意义。根据检测的结果调整患者的用药剂量，既可以使药物发挥最佳的疗效，最大限度地防止毒副反应的发生，也可以避免药物的资源浪费。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种检测ADRB1基因单核甘酸多态性位点的方法，其能够简捷、直观、准确的对ADRB1基因单核苷酸多态性基因型进行检测、分析。为实现以上目的，本专利技术的技术方案为：检测ADRB1基因单核甘酸多态性位点的方法，其具体步骤为：1)特异性引物的设计根据被证实的ADRB1基因标签单核甘酸多态性位点，设计特异性扩增引物、ARMS特异性扩增引物、内标引物、特异性探针、内标探针；其中，所述特异性探针5'端带有荧光基团、3'端带有荧光淬灭基团；2)获得待测样品基因组DNA3)荧光定量PCR扩增以待测标本的DNA为模板，用步骤1)所述的特异性扩增引物进行PCR反应，并分析检测结果。进一步，所述步骤1)中，所述ADRB1基因标签单核甘酸多态性位点包括：ADRB1rs1801252和ADRB1rs1801253位点。ADRB1rs1801252位点即为Ser49Gly，又称为A145G，使编码的49位丝氨酸被甘氨酸取代(Ser→Gly)。ADRB1rs1801253位点即为Arg389Gly，又称为G1165C，使编码的第389位氨基酸由甘氨酸变成精氨酸(Gly→Arg)。内标引物和内边探针组成内标系统。使用内标系统监测该荧光定量PCR反应是否存在抑制，由于待检测的样品中的某些成分可能含有导致PCR出现部分或完全抑制。此外，扩增仪可能存在高于允许范围的孔间差，导致不同管间扩增效率差异。另外人为加样错误也可能导致假阴性结果的出现。因此本专利技术在一些具体实施方案中采用内标系统来消除上述隐患，保证了检测结果的准确性。进一步，ADRB1rs1801252位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；145AARMS特异性扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；145GARMS特异性扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；ADRB1rs1801253位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；1165GARMS特异性扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；1165CARMS特异性扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：11所示，特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示，内标正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：13所示，内标反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示，内标探针的核苷酸序列如SEQIDNO：15所示。详见下表：4条ARMS特异性扩增引物分别在3'端模板碱基与待扩增类型的碱基配对，同时在其3'末端倒数第2-3位增加一个或者两个碱基错配，以增强特异性。特异性探针5'端修饰有FAM或VIC，3'端修饰有非荧光淬灭基团NFQ，该基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度。同时该特异性探针上还连接有MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提高10℃左右。因此同样的Tm值，MGB探针可以比普通Taqman探针设计的更短，使得探针在识别具有单个核苷酸多态性位点时特异性更强。内标系统针对人类基因组保守区域设计，具有高度的灵敏性和扩增特异性。内标探针5'端标记有报告基团，如ROX、FAM、VIC等，3'端标记有不发光荧光淬灭基团，如BHQ2等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在DNA链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5'→3'外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，从而产生荧光信号。因此，检测到的信号强度就代表了模板DNA的拷贝数本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测ADRB1基因单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于，具体步骤为：1)特异性引物的设计根据被证实的ADRB1基因标签单核甘酸多态性位点，设计特异性扩增引物、ARMS特异性扩增引物、内标引物、特异性探针、内标探针；其中，所述特异性探针5'端带有荧光基团、3'端带有荧光淬灭基团；2)获得待测样品基因组DNA3)荧光定量PCR扩增以待测标本的DNA为模板，用步骤1)所述的特异性扩增引物进行PCR反应，并分析检测结果。

【技术特征摘要】
1.检测ADRB1基因单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于，具体步骤为：1)特异性引物的设计根据被证实的ADRB1基因标签单核甘酸多态性位点，设计特异性扩增引物、ARMS特异性扩增引物、内标引物、特异性探针、内标探针；其中，所述特异性探针5'端带有荧光基团、3'端带有荧光淬灭基团；2)获得待测样品基因组DNA3)荧光定量PCR扩增以待测标本的DNA为模板，用步骤1)所述的特异性扩增引物进行PCR反应，并分析检测结果。2.根据权利要求1所述的检测ADRB1基因单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述ADRB1基因标签单核甘酸多态性位点包括：ADRB1rs1801252和ADRB1rs1801253位点。3.根据权利要求2所述的检测ADRB1基因单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于，ADRB1rs1801252位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；145AARMS引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；145GARMS引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；ADRB1rs1801253位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；1165GARMS引物的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；1165CARMS引物的核苷酸序列如SEQIDNO：11所示，特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示，内标正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：13所示，内标反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示，内标探针的核苷酸序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：重庆迪威纳生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50