生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法技术

本发明专利技术公开了一种生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，包括以下步骤：步骤一、以待测样品的DNA为模板，利用通用型引物对进行PCR扩增，扩增片段约为400bp；步骤二、扩增产物建库；步骤三、利用二代测序平台测序；步骤四、数据分析比对确认物种，其中，所述通用型引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术的生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，可以快速鉴定食品、化妆品和饲料中未知动物源性成分，实现真正意义上的全覆盖、无缝生物监测，从源头杜绝动物源性制品掺杂使假等行为，也为检测机构提供技术支持。

【技术实现步骤摘要】
生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法
本专利技术属于生物工程领域，具体地说，是关于一种生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，是基于二代测序技术的通用型物种特异性DNA分析技术，包括通用型引物对、数据库、分析方法、试剂盒与实际应用方法。
技术介绍
动物源性制品的掺假是关系到人类食品安全和畜牧业健康发展的一个重要问题。事实上，饲料和食品安全问题不仅涉及人类的健康，而且涉及相关企业的生存、经济的发展、社会的稳定、甚至是民众对政府的信心等问题。一方面由于不同物种来源的动物组织、皮革、血液等本身具有相似的物理形态以及工业化处理加工技术的影响，普通消费者自己很难准确判定物种来源特别是众多混合动物源性制品各组成部分的真实性。未知来源的动物源性成分存在巨大的经济和安全漏洞，这是关系到人类食品安全和畜牧业健康发展的一个重要问题。事实上，动物源性制品安全问题不仅涉及人类的健康，而且涉及相关企业的生存、经济的发展、社会的稳定、甚至是民众对政府的信心等多方面问题。另一方面国内外目前使用的所有检测技术均不具备对未知来源的动物源性成分进行准确鉴定的能力。因此建立全新的通用型检测方法来对食品和饲料中的动物源性成分进行鉴定的研究显得十分必要和重要。目前在食品安全检测技术方面，基于DNA序列的检测方法如聚合酶链式反应技术(Polymerasechainreaction，PCR)和实时荧光PCR技术(Real-timefluorescencepolymerasechainreaction，qPCR)相比于其他方法具有较高的特异性、灵敏度和稳定性等优点，是目前最重要的检测技术，在食品饲料中转基因成分检测、动物源性成分检测、病原微生物检测、过敏源检测、真假鉴别等方面均具有非常成功和广泛的应用。但这些基于PCR技术的检测方法均具有一个严重的技术瓶颈，只能针对某一物种设计具有针对性的引物，然后针对其进行有目的的检测，如果待测样品是混合样品并具有完全未知的物种，则这些方法均无法完成检测。这一技术瓶颈一直困扰着相关领域检测工作人员。因此，有必要建立一种特异性好、且在一次实验中对混合样品中各已知或未知动物源性成分进行准确定性检测的检测方法。DNA条形码技术是使用一段两端相对保守、中间具有足够区分度的，易于扩增的较短的DNA片段，并利用其具有种间特异性和种内保守性而创建的一种新的生物身份识别系统，以实现对物种的快速鉴定。第二代测序技术(Next-generationsequencing)利用接头技术进行高通量并行PCR以实现大规模平行测序，同时结合微流体技术，利用计算机对测序数据进行拼接和分析，而且DNA被测次数还可以间接反映某种DNA的相对丰度。
技术实现思路
针对现有生物监测技术无法全面甄别不确定动物源性成分的不足，本专利技术的目的在于提供一种生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，是基于高通量测序技术和DNA条形码分析技术的通用型动物源性成分检测方法，包括通用型引物对、数据库、分析方法、试剂盒与实际应用策略。该方法可以实现对复杂混合生物制品中不可预测或未知物种进行准确筛选和鉴定，实现真正意义上的全覆盖、无缝生物监测，从源头杜绝动物源性制品掺杂使假等行为，也为检测机构提供技术支持。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术的第一个目的在于提供一种生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，该通用型检测方法包括以下步骤：步骤一、以待测样品的DNA为模板，利用通用型引物对进行普通PCR扩增，其扩增片段约为400bp；步骤二、扩增产物建库；步骤三、利用二代测序平台测序；步骤四、数据分析比对确认物种，其中，所述通用型引物对的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。根据本专利技术，步骤一的PCR扩增的条件如下：PCR扩增的反应体系为50μL，包括2XTaqMastermix25μL，正向引物、反向引物各10μM，DNA模板5μL；PCR扩增程序为：98℃变性5min；进入循环，96℃变性20s，55℃退火30s和72℃延伸30s，共35个循环；延伸2min。根据本专利技术，所述通用型检测方法还包括参考线粒体数据库的序列。进一步的，所述步骤三是利用IlluminaMiseq测序平台进行测序。进一步的，所述步骤三是采用IonTorrent半导体测序平台进行测序。本专利技术的第二个目的在于提供一种生物制品中动物源性成分的通用型引物对，所述通用型引物对的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。本专利技术的第三个目的在于提供一种上述所述的生物制品中动物源性成分的通用型引物对用于高通量二代测序。本专利技术的有益效果是：1、提供了一种针对复杂动物源性成分进行快速鉴定的技术，该检测技术创造性结合二代测序技术和物种特异性线粒体DNAbarcode技术，针对食品、化妆品和饲料中混合未知动物源性成分进行快速鉴定。2、与所有传统检测技术相比，不再需要使用特异性的引物有针对性的对某单一物种进行一对一检测，而是通过一次实验将待测样本中的各种动物源性成分进行准确区分鉴定，节省大量人力物力。3、这一技术可以解决生物制品中大量不可预见动物源性成分难以同时鉴定的技术难题，从源头杜绝动物源性制品制假掺假等行为，从根本上堵住安全漏洞。4、该通用型检测技术在多个领域具有广泛的科技应用价值：如食品安全领域，可以应用于肉类食品质量监督，为执法部门提供技术依据；在疾病控制领域，可以严防动物性疫病疫区的动物源性制品携带病毒传入我国，为我国畜牧业安全保驾护航；在国际贸易领域，可以为进出口企业消除贸易技术壁垒、为出入境检验检疫部门提供技术保障，为国际贸易纠纷仲裁提供技术支持；还可以为其它相关学科领域如物种分类学、比较遗传学、动物生态学提供一个新颖的研究方向和可靠的研究手段。5、该方法自动化程度高，人为操作影响弱，操作简便，对人员要求低，适用范围广。附图说明图1为生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的结构示意图。图2为实施例2的待测样品等比例混合的物种分布和丰度的示意图。图3为实施例3的待测样品等比例混合的物种分布和丰度的另一示意图。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。以下实施例的待测样品的线粒体基因组购自于ZyagenLaborateorie(SanDiego,CA,USA)，具体如表1所示。表113种待测样品的来源和序列情况以下实施例的参考线粒体数据库的序列来源于在线NCBI数据库，如表2所示。其中表2仅列出参考线粒体数据库的部分动物线粒体DNA的序列来源。表2参考线粒体数据库实施例1通用型动物源性成分特异性扩增引物的设计本申请人通过设计多组引物，发现采用本专利技术的通用型动物源性成分特异性扩增引物对进行生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测的效果最好。(1)本专利技术的通用型动物源性成分特异性扩增引物的序列如下：NGS-382-FTAAGACGAGAAGACCCTRTGGA(SEQIDNO：1)NGS-382bp-RCGGTCTGAACTCAGATCACGTA(SEQIDNO：2)(2)PCR的反应体系和反应程序见表3和表4表3PCR反应体系成分体积(μl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、以待测样品的DNA为模板，利用通用型引物对进行PCR扩增，扩增片段约为400bp；步骤二、扩增产物建库；步骤三、利用二代测序平台测序；步骤四、数据分析比对确认物种，其中，所述通用型引物对的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、以待测样品的DNA为模板，利用通用型引物对进行PCR扩增，扩增片段约为400bp；步骤二、扩增产物建库；步骤三、利用二代测序平台测序；步骤四、数据分析比对确认物种，其中，所述通用型引物对的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。2.如权利要求1所述的生物制品中动物源性成分的高通量二代测序的通用型检测方法，其特征在于，步骤一的PCR扩增的条件如下：PCR扩增的反应体系为50μL，包括2XTaqMastermix25μL，正向引物、反向引物各10μM，DNA模板5μL；PCR扩增程序为：98℃变性5min；进入循环，96℃变性20s，55℃退火30s和72℃延伸30s，共35...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡一村，何宇平，潘良文，
申请(专利权)人：上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：上海,31