一种基于第二代测序技术平台的地沟油检测方法技术

本发明专利技术公开一种基于第二代测序技术平台的地沟油检测方法，包括以下步骤：步骤a、待检油品样本DNA提取及质检；步骤b、在第二代测序技术平台上构建DNA文库并质检；步骤c、上机测序及分析。通过对待检油品样本提取DNA后，直接构建DNA文库，利用第二代测序技术，直接测序，通过序列的生物信息学分析，可直接定性油品。本发明专利技术通过对油品中残存DNA的直接测序，直接定性油品，其检测特异性强，可应用于多重测序平台，且一次可以检测百余个样本，通量高，操作方便且可行性高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体地说是涉及一种基于第二代测序技术平台的地沟油检测方法。
技术介绍
食物油作为人们每天餐桌上的必需品，不仅能使食物更美味，也能为人们提供身体必需的营养物质。作为各类烹调方式必备的基础物质条件，食用油的安全与放心可以说是饭桌安全的重要环节。在目前的食用油掺伪行为当中，最严重、最恶劣同时也最被广泛关注的，当属地沟油的非法回收、再加工行为，称为地沟油造假。地沟油，是人们对于各种劣质油脂的总称，人们往往也将其称为“餐桌回收油”或者“潲水油”。地沟油目前被研究学者们分为广义上的和狭义上的两类，狭义的地沟油指的是那些通过网呢等打榜方式，从下水道、阴沟、河流中收集，经过特定的脱色、除臭、精炼技术加工提炼的餐饮业再生劣质油脂，广义的地沟油即包括一切非法的地沟油，比如餐饮店使用的泛油、煎炸老油等。不论是哪种来源的地沟油，在历经了下水道的氧化、腐败过程与多次高温反复作用，其组成成分都发生了变化，不仅营养成分严重下降，更严重的是产生了如黄曲霉毒素B1、苯并(a)花、反式脂肪酸等各种有毒有害物质，并含有有毒的表面活性剂成分。人们若是长期食用这类劣质油，将会对健康造成相当大的影响，引发身体的病变。症状较轻的会有消化不良、腹胀等现象，严重的患者会发生贫血、中毒性肝病等急性病症，而长期食用还有诱发恶性肿瘤的危险，危害性极大。目前国内对地沟油的鉴别和检测主要是从感官和理化检验两个方面进行。理化检测分别检验水分含量、比重、折光率、皂化值、酸值、羰基值、过氧化值、碘值重金属、脂肪酸相对不饱和度、胆固醇、残留检测、氧化产物等指标。地沟油由于经过水洗、蒸馏、脱色、脱臭等精炼工艺后，或者与普通食用植物油掺兑之后，已经很难用常规的感官分析或者理化指标等进行区分。另外近几年也提出来对油品的基因检测，利用荧光定量PCR技术，通过设计多对动物源性的引物，根据PCR结果，考察油品中是否含有某个动物源性基因。这种检测方法，虽然简单、快速，但是只能作为辅助鉴定方法，并不能作为直接的定性检测技术；而且由于引物数量的限制，上述检测技术并不能涵盖所用物种，很容易造成假阴性；另外，由于油品中的基因严重降解，并不能肯定检测不出特定基因，就能说明该油品就不是地沟油。因此，不得不说，目前国内尚缺乏能够有效鉴定地沟油的直接检测方法。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术的目的是针对现有技术中鉴定方法无法直接定性油品是否为地沟油，且辅助鉴定技术特异性差、操作复杂、检测成本高、假阴性等问题，提供了一种基于第二代测序技术平台的地沟油检测方法，该方法通过对油品中残存DNA的直接测序，直接定性油品，其检测特异性强，可应用于多重测序平台，包括iLLumina测序平台，不仅限于HISEQ2000、HISEQ2500、Miseq、Nextseq500等；也可用于IONTORRENT测序平台，且一次可以检测百余个样本，通量高，操作方便且可行性高。本专利技术的技术方案如下：一种基于第二代测序技术平台的地沟油检测方法，包括以下步骤：步骤a、待检油品样本DNA提取及质检；步骤b、在第二代测序技术平台上构建DNA文库并质检；步骤c、上机测序及分析。步骤a包括：首先，取9mL待检油品，加1mLTE缓冲液，室温震荡摇匀5min，12000rpm离心10min，去除上层油脂层，重复操作2-6次；其次，利用磁珠法，抽提核酸，加入50μL的TE缓冲液溶解；最后，DNA质检，利用Qubit检测DNA浓度和纯度。步骤b包括：首先进行末端修复及纯化，从-20℃冰箱内取出末端修复缓冲液溶解，充分混匀；将末端修复缓冲液和末端修复酶，置于冰盒上，依照表1配置反应体系；然后混合均匀，微离心后，20℃温浴30min；反应结束后，利用磁珠纯化，回收DNA，溶于25μL的TE缓冲液中；其次进行加接头及纯化，从-20℃冰箱内取出连接缓冲液、PE接头溶液、Barcode接头溶液，融化后充分混匀；取出连接酶、修复酶，置于冰上，依照表2配置连接反应体系；连接反应体系配置完成后，混合均匀并微离心，置于20℃条件下温浴30min；反应结束后，利用磁珠纯化，回收DNA，溶于40μL的TE缓冲液中；然后进行文库扩增及纯化，从-20℃冰箱内取出PCR缓冲液和PCR酶、引物1、引物2，依照表3配置PCR反应体系，PCR反应体系配置完成后，混合均匀并微离心，将样本置于PCR仪中，运行PCR反应程序，PCR反应程序结束后，利用磁珠纯化，回收DNA，溶于20μL的TE缓冲液中；最后利用Qubit或荧光定量PCR、AgiLent2100检测文库DNA的浓度，依据各样本DNA浓度关系及测序数据量的关系，对样本进行混样。步骤c包括生物信息学分析；首先将测序数据经过初步处理，去除低质量、接头序列；根据cLean的数据，去除重复序列；然后数据做BLAST对比，将测序数据与油品理论来源基因组做Mapping，未Mapping上的序列，与nt/nr数据做BLAST，鉴定是否为含有其他来源基因组；最后鉴定为何种油品：将测序数据直接与nt/nr数据做BLAST，或者将数据做拼接后再与nt/nr数据做BLAST，通过统计BLAST结果，鉴定是单一来源，还是多物种来源，以此鉴定为何种来源油品还是复杂来源的地沟油品。本专利技术的有益效果是所述基于第二代测序技术平台的地沟油检测方法，通过对油品中残存DNA的直接测序，直接定性油品，其检测特异性强，可应用于多重测序平台，包括iLLumina测序平台，不仅限于HISEQ2000、HISEQ2500、Miseq、Nextseq500等；也可用于IONTORRENT测序平台，且一次可以检测百余个样本，通量高，操作方便且可行性高。具体实施方式下面对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本专利技术公开一种基于第二代测序技术平台的地沟油检测方法，包括以下步骤：步骤a、待检油品样本DNA提取及质检；步骤b、在第二代测序技术平台上构建DNA文库并质检；步骤c、上机测序及分析。步骤a包括：首先，取9mL待检油品，加1mLTE缓冲液，室温震荡摇匀5min，12000rpm离心10min，去除上层油脂层，重复操作2-6次；其次，利用磁珠法，抽提核酸，加入50μL的TE缓冲液溶解；最后，DNA质检，利用Qubit检测DNA浓度和纯度。步骤b包括：首先进行末端修复及纯化，从-20℃冰箱内取出末端修复缓冲液溶解，充分混匀；将末端修复缓冲液和末端修复酶，置于冰盒上，依照表1配置末端修复反应体系；表1：末端修复反应体系组分反应体系(μL)样本DNA21.5末端修复缓冲液8末端修复酶0.5反应体系总量30然后混合均匀，微离心后，20℃温浴30min；反应结束后，利用磁珠纯化，回收DNA，溶于25μL的TE缓冲液中；其次进行加接头及纯化，从-20℃冰箱内取出连接缓冲液、PE接头溶液、Barcode接头溶液，融化后充分混匀；取出连接酶、修复酶，置于冰上，依照表2配置连接反应体系；表2：连接反应体系组分反应体系(μL)修复产物20连接缓冲液3dNTP1DNA连接酶0.5修复酶0.5PE接头溶液1Barcode接头溶液1无核酸水3总体系30连接反应体系配置完成后，混合均匀并微离心，置于20℃条件下温浴30本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于第二代测序技术平台的地沟油检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤a、待检油品样本DNA提取及质检；步骤b、在第二代测序技术平台上构建DNA文库并质检；步骤c、上机测序及分析。

【技术特征摘要】
1.一种基于第二代测序技术平台的地沟油检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤a、待检油品样本DNA提取及质检；步骤b、在第二代测序技术平台上构建DNA文库并质检；步骤c、上机测序及分析。2.根据权利要求1所述的基于第二代测序技术平台的地沟油检测方法，其特征在于：所述步骤a包括：首先，取9mL待检油品，加1mLTE缓冲液，室温震荡摇匀5min，12000rpm离心10min，去除上层油脂层，重复操作2-6次；其次，利用磁珠法，抽提核酸，加入50μL的TE缓冲液溶解；最后，DNA质检，利用Qubit检测DNA浓度和纯度。3.根据权利要求1所述的基于第二代测序技术平台的地沟油检测方法，其特征在于：所述步骤b包括：首先进行末端修复及纯化，从-20℃冰箱内取出末端修复缓冲液溶解，充分混匀；将末端修复缓冲液和末端修复酶，置于冰盒上，依照表1配置反应体系；然后混合均匀，微离心后，20℃温浴30min；反应结束后，利用磁珠纯化，回收DNA，溶于25μL的TE缓冲液中；其次进行加接头及纯化，从-20℃冰箱内取出连接缓冲液、PE接头溶液、Barcode接头溶液，融化后充分混匀；取出连接酶、修复酶，置于冰上，依照表2配置连接反应体系；连接反应体系配置完成后，混合均匀并微离心，置于2...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵晓芳，
申请(专利权)人：江苏苏博生物医学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32