一种用于适应性抗病毒防御的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关复合物(级联)；所述级联蛋白质复合物至少包含CRISPR相关蛋白质亚基Cas7、Cas5和Cas6，其包括至少一个具有额外的氨基酸序列的亚基，该额外的氨基酸序列具有核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑制活性。所述具有额外的活性的级联复合物与RNA分子组合，以产生核糖核蛋白复合物。该RNA分子被选择为与靶序列具有实质互补性。靶向的核糖核蛋白可用作遗传工程工具，在同源重组、非同源末端连接、基因修饰、基因整合、突变修复中用于核酸的精确切割，或用于它们的可视化、转录激活或抑制。与FokI二聚体融合的一对核糖核苷酸可用于在DNA中产生双链断裂，从而以序列特异性的方式促进这些应用。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】一种用于适应性抗病毒防御的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关复合物(级联)；所述级联蛋白质复合物至少包含CRISPR相关蛋白质亚基Cas7、Cas5和Cas6，其包括至少一个具有额外的氨基酸序列的亚基，该额外的氨基酸序列具有核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑制活性。所述具有额外的活性的级联复合物与RNA分子组合，以产生核糖核蛋白复合物。该RNA分子被选择为与靶序列具有实质互补性。靶向的核糖核蛋白可用作遗传工程工具，在同源重组、非同源末端连接、基因修饰、基因整合、突变修复中用于核酸的精确切割，或用于它们的可视化、转录激活或抑制。与FokI二聚体融合的一对核糖核苷酸可用于在DNA中产生双链断裂，从而以序列特异性的方式促进这些应用。【专利说明】 本专利技术涉及遗传工程领域，更具体地涉及生物体（包括原核生物和真核生物）的 基因和/或基因组修饰领域。本专利技术还涉及制作在基因组分析和遗传修饰方法中使用（无 论体内还是体外）的位点特异性工具的方法。本专利技术更具体地涉及以序列特异性方式识别 并关联于核酸序列的核糖核蛋白的领域。 细菌和古细菌具有多种多样的针对侵入性DNA的防御机制。所谓的CRISPR/Cas 防御系统通过将质粒和病毒DNA片段整合到宿主染色体上的成簇规律间隔短回文重复序 列（CRISPR)的基因座中来提供适应性免疫。病毒或质粒来源的序列，被称为间隔区，由重 复的宿主来源的序列彼此隔开。这些重复元件是该免疫系统的遗传记忆，并且每个CRISPR 基因座都含有在先前遇到外来遗传元件期间获得的独特"间隔区"序列的多样的所有组成 成分（repertoire) 〇 外来DNA的获得是免疫的第一步，但是保护则需要将CRISPR转录，并且需要将这 些长的转录物加工成短的CRISPR来源的RNA(crRNA)，这些CRISPR来源的RNA各自含有与 外来核酸攻击物（challenger)互补的独特间隔区序列。 除了 CrRNA，在若干生物体中的遗传实验已表明，获得免疫力的步骤、CrRNA生物 发生和靶向干扰还需要一组独特的CRISPR相关（Cas)蛋白质。另外，来自在系统发生上不 同的CRISPR系统的Cas蛋白亚组已被证明装配成包括crRNA的大复合物。 最近对CRISPR/Cas系统的多样性的重新评估导致分类为三种不同的类型 (Makarova K?等人（2011)Nature Reviews Microbiology-A0P, 2011 年 5 月 9 日； doi : 10. 1038/nrmicro2577)，这些类型在cas基因含量上有所不同，并在整个CRISPR防御 途径中显现出很大的差异。（本说明书中对CRISPR相关基因采用了 Makarova分类和命名 法。）CRISPR基因座的RNA转录物（前crRNA)在I型和III型系统中被CRISPR相关（Cas) 内切核糖核酸酶或在II型系统中被RNAase III在重复序列上特异性切割；生成的crRNA 被Cas蛋白复合物所利用，作为引导RNA来检测入侵DNA或RNA的互补序列。靶核酸的切 割已在体外针对以尺子锚定机制（ruler-anchored mechanism)切割RNA的强烈火球菌 (Pyrococcus furiosus) III-B型系统得到证实，并且最近在体内针对在互补祀序列（原间 隔区（protospacer))上切割 DNA 的嗜热链球菌（Streptococcus thermophiles) II 型系统 得到证实。相比之下，对I型系统而言，CRISPR干扰的机制仍然在很大程度上是未知的。 模式生物体大肠杆菌（Escherichia coli)菌株K12拥有CRISPR/Cas I-E型（之 前被称为CRISPR E亚型（Cse))。它含有八个cas基因（casl、cas2、cas3和csel、cse2、 cas7、cas5、cas6e)和下游CRISPR(2型重复）。在大肠杆菌K12中，这八个cas基因编码在 CRISPR基因座的上游。Casl和Cas2似乎不是靶向干扰所需要的，而很有可能参与新靶序列 的获得。相比之下，六种〇 &8蛋白刃861、〇862工&83、0&87工 &85和〇8866(之前也分别被称 为CasA、CasB、Cas3、CasC/Cse4、CasD和CasE/Cse3)对于针对入噬菌体攻击的保护而言 是必需的。这些蛋白质中的五种<861、〇862乂 &87、0&85和0&866(之前分别被称为0 &8八、 CasB、CasC/Cse4、CasD 和 CasE/Cse3)与 crRNA -起装配以形成被称为级联（Cascade)的 多亚基核糖核蛋白（RNP)。 在大肠杆菌中，级联（Cascade)是一种405kDa的核糖核蛋白复合物，其由化学计 量不等的五种功能上必需的Cas蛋白Csel 1CseZ2CasT6CasS1Casee1 (即，按以前的命名法为 CasA1B2C6D1E 1)以及61-nt CRISPR来源的RNA所组成。级联是专性RNP，其依赖于crRNA以 供复合物装配和稳定性以及入侵核酸序列的鉴别。级联是一种监视复合物，其发现并结合 与crRNA的间隔区序列互补的外来核酸。标题为"Structural basis for CRISPR RNA-guided DNA recognition by Cascade" 的 Jore 等人（2011)，Nature Structural&Molecular Biologyl8:529 - 537 描述 了前crRNA转录物如何被级联的Cas6e亚基所切割，从而导致成熟的6 Int crRNA被CRISPR 复合物所保留。crRNA作为引导RNA，用于通过crRNA间隔区与互补的原间隔区之间的碱基 配对，级联与双链（ds)DNA分子的序列特异性结合，从而形成所谓的R-环。已知这是一个 ATP非依赖性的过程。标题为 "Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes，'的 fcouns S. J. J?等人（2008)，Science 321:960-964 教导了载有 crRNA 的级联需要 Cas3 来 形成体内噬菌体抗性。标题为 "CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea，' 的 Marraffini L.和 Sontheimer E. (2010), Nature Reviews Genetics 11:181-190是一篇综述文章，其总结了本领域现有技术的知识状态。针对基于CRISPR的应 用和技术提出了一些建议，但这主要是在产生用于乳制品行业的驯化细菌的噬菌体抗性株 的领域。提出强烈火球菌中crRNP复合物对RNA分子的体外特异性切割还有待于进一步开 发。还提出对CRISPR系统的操作是一种可能的在医院中减少抗生素抗性菌株传播的方式。 作者强调，将需要进一步本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于抗病毒防御的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关复合物(级联)，该级联蛋白质复合物或其部分至少包含CRISPR相关蛋白质亚基：‑Cas7，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与之有至少18％同一性的序列，‑Cas5，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与之有至少17％同一性的序列，和‑Cas6，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与之有至少16％同一性的序列；并且其中至少一个亚基包括提供核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑制活性的额外的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：斯坦·乔翰·约瑟夫·布朗兹，约翰·万德奥斯特，
申请(专利权)人：瓦赫宁根大学，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL
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