热稳定的Cas9核酸酶制造技术

编码来自热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)的ThermoCas9蛋白的多核苷酸和组成型启动子被用于工程化真核细胞，例如真菌、酵母或藻类，使得ThermoCas9核酸内切酶被整合并从细胞的基因组表达。然后，使用第二表达质粒转染这些表达ThermoCas9的细胞，第二质粒包含诱导型启动子和编码指导RNA(guide RNA)的多核苷酸。指导RNA与ThermoCas9组合，以提供靶向的核酸内切酶活性，以在期望的基因座或感兴趣的基因处裂解细胞DNA。还向细胞提供了修复寡聚物，由此在DNA裂解后，同源重组发生在具有修复寡聚物的细胞中，使得在感兴趣的基因座或基因中实现核苷酸的缺失或取代。描述了表达载体和使用所述载体以实现ThermoCas9介导的基因编辑的方法，由此使用更高的温度，例如大于30℃。

Heat stable cas9 nuclease

Polynucleotide and constitutive promoters encoding thermocas9 protein from Geobacillus thermodenitrificans are used to engineer eukaryotic cells, such as fungi, yeast or algae, so that thermocas9 endonuclease is integrated and expressed from the cell genome. These thermocas9 expressing cells were then transfected with a second expression plasmid containing an inducible promoter and a polynucleotide encoding a guide RNA. Guide the combination of RNA and thermocas9 to provide targeted endonuclease activity to cleave cell DNA at desired loci or genes of interest. Repair oligomers are also provided to cells, so homologous recombination occurs in cells with repair oligomers after DNA cleavage, which makes nucleotide deletion or substitution in gene loci or genes of interest. The expression vector and the method of using the vector to achieve thermocas9 mediated gene editing are described, thereby using a higher temperature, for example, greater than 30 \u2103.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】热稳定的Cas9核酸酶专利
本专利技术涉及遗传工程(geneticengineering)领域，并且更特别地涉及核酸编辑和基因组修饰。本专利技术涉及呈核酸酶的形式的遗传工程工具，所述核酸酶可以被配置用于遗传物质的序列指导的位点特异性结合、切口(nicking)、切割和修饰；还涉及对遗传物质的序列特异性位点发挥活性(特别地，核酸酶活性)的核糖核蛋白、以及用于作为标志物使用的修饰的核酸酶和核糖核蛋白。因此，本专利技术还涉及用于在非人类细胞中递送和表达核酸酶和指导RNA(guideRNA)的相关的表达构建体。此外，本专利技术涉及体外或体内的核酸的序列特异性编辑和被用于实现所述编辑的方法。本专利技术涉及的特定领域是嗜热生物体(特别地，微生物)的遗传操作。专利技术背景在2007年首次证明CRISPR-Cas是在许多细菌和大多数古核生物(archaea)中的适应性免疫系统(Barrangou等人，2007，Science315：1709-1712，Brouns等人，2008，Science321：960-964)。基于功能和结构标准，迄今已经表征了两类CRISPR-Cas系统，每一类CRISPR-Cas系统包括三种类型，其中大多数使用小RNA分子作为指导(guide)以靶向互补的DNA序列(Makarova等人，2015，NatRevMicrobiol13：722-736；Mahanraju等人，2016，Science353：aad5147)。在Doudna/Charpentier实验室的最近的一项研究中，对第2类/II型CRISPR-Cas系统的效应酶(Cas9)进行了彻底的表征，包括证明设计的CRISPRRNA指导(具有特定间隔区序列)的引入靶向了质粒上的互补序列(前间区(protospacers))，引起该质粒的双链断裂(Jinek等人，2012，Science337：816-821)。继Jinek等人，2012之后，Cas9被用作用于基因组编辑的工具。Cas9已经被用于工程化一系列真核细胞(例如鱼、植物、人类)的基因组(Charpentier和Doudna，2013，Nature495：50-51)。另外，通过选择专门的重组事件，Cas9已经被用于改进细菌中同源重组的产率(Jiang等人，2013，NatureBiotechnol31：233-239)。为了实现这一点，将毒性片段(靶向构建体)与携带期望的改变的救援片段(编辑构建体，携带点突变或缺失)共转染。靶向构建体由Cas9与设计的CRISPR的组合和抗生素抗性标志物组成，定义了在宿主染色体上的期望重组的位点；在对应的抗生素的存在下，选择靶向构建体在宿主染色体中的整合。仅当编辑构建体与宿主染色体上的CRISPR靶位点发生另外的重组时，宿主可以逃脱自身免疫问题。因此，在抗生素的存在下，仅期望的(无标志物的)突变体能够存活和生长。还呈现了选择用于随后从染色体去除整合的靶向构建体的相关的策略，生成真正的无标志物突变体。在最近几年，已经建立了CRISPR-Cas介导的基因组编辑构成用于遗传工程的有用的工具。已经建立了原核CRISPR系统作为适应性免疫系统为其宿主服务(Jinek等人，2012，Science337：816-821)，并且可以被用于快速和有效的遗传工程(例如，Mali等人，2013，NatMethods10：957-963)，仅需要指导序列的修饰以靶向感兴趣的序列。然而，对开发应用于遗传研究和基因组编辑领域中的在多种实验条件下具有改进的序列特异性核酸检测、裂解和操作的剂仍存在持续的需求。特别地，目前可得的序列特异性基因组编辑工具，包括Cas9，不适用于在所有条件或生物体中使用，例如，序列特异性核酸酶是相对地热敏感的，并且因此不适用于在严格嗜热微生物(其能够在41℃与122℃之间生长，并且能够在从＞45℃至80℃的温度范围中最佳生长，其中极端嗜热菌(hyperthermophiles)能够在80℃以上最佳生长)，例如，在工业发酵中使用的微生物或用于在升高的温度进行的体外实验室过程的微生物中使用。迄今，不存在关于嗜热菌(thermophiles)中有活性的Cas9蛋白的实验证据。基于由Chylinski等人(2014；NucleicAcidsResearch42：6091-61-05)对细菌中Cas9的存在的比较基因组筛选，发现II-C型CRISPR-Cas系统仅存在于所有细菌基因组的约3.3％中。在嗜热细菌中，基于统计学分析，II型系统的代表性不足(P＝0.0019)。另外，然而，在古核生物中尚未发现II型系统，这可以可能是由于在古核生物中不存在RNA酶III蛋白(参与II型系统)。Chylinski等人(2014；NucleicAcidsResearch42：6091-6105确实描述了II型CRISPR-Cas系统的分类和演化，特别地，鉴定出了表现出这些系统的两个物种，然而这些物种在55℃最大生长，并且没有表现出严格嗜热生长，其中最佳生长温度为60-80℃，而极端嗜热菌能够在80℃以上最佳地生长。尽管CRISPR-Cas系统在细菌基因组中的稀有性，并且特别是仅在具有低于45℃的最佳生长温度的细菌(非古核生物)中已经发现Cas9的事实，本专利技术人已经出乎意料地发现了几种能够在升高的温度进行基因组编辑的热稳定的Cas9变体。本专利技术人还已经发现了优化的前间区相邻基序(PAM)序列，该优化的前间区相邻基序(protospaceradjacentmotif；PAM)序列与热稳定的Cas9变体一起起作用，以使基因组编辑能够在宽范围的温度中进行，包括在升高的温度。这些Cas9核酸酶和通过相关的PAM序列的知识设计的RNA分子，提供了用于在升高的温度进行遗传工程的新型工具，并且在嗜热生物体(特别地，微生物)的遗传操作中具有特别的价值。最近已经进行了嗜热属即地芽孢杆菌属(Geobacillus)的系统发育重新评估，结果创建了一个新的属——副地芽孢杆菌属(Parageobacillus)。因此，先前的地芽孢杆菌属的一些物种已经被系统地重新分配至副地芽孢杆菌属，并且相应地重新命名(Aliyu等人，(2016)SystematicandAppliedMicrobiology39：527-533)。成簇的规律地间隔的短回文重复(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)(CRISPR)和CRISPR相关的(Cas)蛋白在原核生物中提供了针对入侵的遗传元件的适应性和遗传性免疫(Brouns等人Science321，(2008)；Barrangou等人CRISPRprovidesacquiredresistanceagainstvirusesinprokaryotes.Science315，(2007)；Wright等人Cell164，29-44(2016)；Mohanraju等人Science353，aad5147(2016))。CRISPR-Cas系统根据其复杂性和特征蛋白被次分配到两类(1和2)和六个类型(I-VI)中(Makarova等人Nat.Rev.Microbiol.13，722-736(2015))。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种修饰真核细胞的遗传物质的方法，所述方法包括(i)将在第一启动子的控制下编码ThermoCas9的多核苷酸整合到所述细胞的基因组中，其中所表达的ThermoCas9包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少77％同一性的序列，或其活性片段；(ii)用表达载体转化所述细胞，所述表达载体包含编码指导RNA并且在第二启动子的控制下的多核苷酸序列，其中所述指导RNA具有识别在所述细胞的基因组中在期望的靶基因座处包含的核酸序列的核酸序列，和(iii)用修复寡核苷酸转化所述细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.14 EP PCT/EP2016/081077;2017.08.16 EP PCT/1.一种修饰真核细胞的遗传物质的方法，所述方法包括(i)将在第一启动子的控制下编码ThermoCas9的多核苷酸整合到所述细胞的基因组中，其中所表达的ThermoCas9包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或与SEQIDNO:1具有至少77％同一性的序列，或其活性片段；(ii)用表达载体转化所述细胞，所述表达载体包含编码指导RNA并且在第二启动子的控制下的多核苷酸序列，其中所述指导RNA具有识别在所述细胞的基因组中在期望的靶基因座处包含的核酸序列的核酸序列，和(iii)用修复寡核苷酸转化所述细胞。2.一种修饰真核细胞的遗传物质的方法，所述方法包括(i)将在第一启动子的控制下编码ThermoCas9的多核苷酸整合到所述细胞的基因组中，其中所表达的ThermoCas9包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或与SEQIDNO:1具有至少77％同一性的序列，或其活性片段；(ii)用表达载体转化所述细胞，所述表达载体包含在所述第一启动子或单独的第二启动子的控制下编码指导RNA的多核苷酸序列和同样在所述第一启动子或所述第二启动子或单独的第三启动子的控制下的修复寡核苷酸，其中所述指导RNA具有识别在所述细胞的基因组中在期望的靶基因座处包含的核酸序列的核酸序列。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述修复寡核苷酸是双链DNA修复寡聚物；任选地包含用于在指导RNA指导的ThermoCas9核酸内切酶切割后通过同源重组的方式插入所述细胞的基因组中的多核苷酸序列。4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第一启动子是组成型启动子。5.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第一启动子是诱导型启动子。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二启动子是组成型启动子或诱导型启动子。7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述第三启动子是组成型启动子或诱导型启动子。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过热激用一种或更多种表达质粒和/或修复寡聚物转化所述细胞。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞在26℃-60℃的范围中的温度，优选地31℃-60℃的范围中的温度；更优选地35℃-60℃的范围中的温度；甚至更优选地34℃-41℃的范围中的温度，例如37℃的温度被转化和/或在转化后生长。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述真核细胞是酵母，例如酵母属的种(Saccaharomycessp.)。11.一种多核苷酸表达载体，所述多核苷酸表达载体用于修饰宿主生物体的靶基因座处的遗传物质，所述宿主生物体包含所述表达载体，所述载体包含：a)编码ThermoCas9核酸酶的多核苷酸序列，其中所述ThermoCas9核酸酶包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或与SEQIDNO:1具有至少77％同一性的序列，或其活性片段；b)编码指导RNA的多核苷酸序列，其中所述指导RNA具有识别在所述靶基因座中包含的核酸序列的核酸序列；c)相对于(a)和(b)的多核苷酸序列朝向的第一启动子，以驱动所述多核苷酸序列在所述生物体中的表达。12.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰·万德奥斯特，理查德·范克拉嫩堡，艾勒克·芬纳·博斯马，扬尼斯·莫加科斯，普拉塔纳·莫汉拉朱，
申请(专利权)人：瓦赫宁根大学，科学技术基金会，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL