利用双重标记固定化探针的固相中的靶核酸序列检测制造技术

本发明专利技术涉及利用双重标记固定化探针及该双重标记固定化探针对于DNA聚合物的5’→3’外切核酸酶活性的抵抗性，在固相检测靶核酸序列的新颖方法。本发明专利技术中，由于通过内部核苷酸碱基成分的标记引发的对于核酸酶的抵抗性，使标记残留在固相基质上，因此，无需考虑在固相基质上使标记残留的适合的位点。本发明专利技术由于能够自由决定探针上的内部标记的位点，因此，将标记位于使探针上的双重标记系统的猝灭效率最大化的适合的位点，从而使本底信号最小化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用双重标记固定化探针的固相中的靶核酸序列检测
本专利技术涉及利用双重标记固定化探针及该双重标记固定化探针对于DNA聚合酶的5’ 一 3’外切核酸酶活性的抵抗性，在固相中检测靶核酸序列的新颖方法。
技术介绍
基于DNA的微陈列技术作为能够对基因或基因簇的存在、水平或表达模式进行分析的有前途的技术备受瞩目(Schena et al., 1995.Quantitative Monitoring of GeneExpression Patterns with a Complementary DNA Microarray, Science,270:467-470;DeRisi et al.,1996,Use of a cDNA Microarray to Analyse Gene Expression Patternsin Human Cancer, Nature Geneticsl4:457_460)o现有的DNA微陈列一般来说是将已标记的靶序列与固定于固相基质的探针进行杂交，来对标记中的信号进行检测，从而检测靶序列。但是，向靶序列直接进行标记在费用及时间方面不具有有效性，并且，对靶序列的水平(level)产生影响的可能性高。为了克服此类现有的微陈列技术的问题，提出了代替利用标记的靶序列的分子信标探针(molecular beacon probe)(Steemers et al.,Nat Biotechnol, 18:91-94 (2000)；Kim et al., Biosensors Bioelectronics, 22:1041-1047 (2007))。利用突光共振能量转移(FRET, fluorescence resonance energy transfer)现象的分子信标探针技术只在上述探针与靶序列进行杂交的情况下提供荧光信号，因此，能够对靶序列以实时方式进行检测。但是,大大依赖与祀序列的杂交的很多方法由于交叉反应(cross reactions),在假阳性数据产生严重的问题，因此，存在需要改善最终杂交信号的可靠性的问题。在利用固定化的双重标 记探针的杂交过程之外，利用追加性的外切核酸酶反应的几个接近法，提出了例如，固相中的TaqMan (拖慢)探针法(Liu et al., Nucleic AcidRes.34:e4 (2006))。Liu等在固相基质上利用固定化的双重标记探针，并在探针的5’-末端与猝灭分子相连接，在3’ -末端与荧光报道分子相连接。上述探针在上游引物的延长过程中，被DNA聚合酶的5’ 一3’核酸酶活性切割。在进行切割反应后，猝灭分子会分离，而荧光报道分子残留于固相基质，对固相基质中生成的荧光信号进行检测，从而最终对靶序列进行检测。不仅仅是杂交，利用引物依赖性5’ 一 3’核酸酶活性的TaqMan探针陈列方法在提高固相中的靶特异性的同时，还能以实时方式检测靶序列。但是，TaqMan探针陈列方法中的DNA聚合酶的引物依赖性5’ 一 3’核酸酶活性连荧光报道分子标记的核苷酸也能切割，因此，在固相基质无法残留荧光报道分子。为了克服此类问题，设计双重标记探针使荧光报道分子位于不被DNA聚合酶的引物依赖性5’ 一 3’核酸酶活性切割的非切割部位。由于在切割反应期间被切割而缩短的探针由靶核酸序列得到改性，因此可决定探针上的非切割部位。为了这种目的，将荧光报道分子位于3’ -末端。因此，TaqMan探针的陈列方法中，猝灭分子和荧光报道分子之间的距离逐渐变大。探针上的双重标记的距离越远，双重标记系统的猝灭效率会降低。较低的猝灭效率根据位点产生相互不同的本底信号，最终表示错误的结果。而且，由于TaqMan探针陈列方法利用DNA聚合酶的引物-依赖性5’ 一 3’核酸酶活性，因此，需要上游引物。这种对追加的寡核苷酸(上游引物)的使用相关的限制很难定立用于多重靶检测的微陈列上的反应条件，并且，这会成为产生假阳性结果的因素之一。另一方面，W02008/011004公开一种利用DNA聚合酶的引物独立性切割活性的线性指数聚合酶链式反应(LATE-PCR, Linear-After-The-Exponential PCR)中的祀检测方法。利用DNA聚合酶的引物依赖性5’ 一 3’核酸酶活性的基于TaqMan探针的方法，与该方法不同，W02008/011004中的DNA聚合酶的引物独立性5’ 一 3’核酸酶活性并不需要引物的帮助。而且，W02008/011004公开通过3个以上的亚甲基(CH2)的标记和探针的5’ -末端之间的结合，使探针被DNA聚合酶的引物独立性5’ 一 3’核酸酶活性更加有效的切割，相反，未利用亚甲基(CH2)链的标记和探针的5’-末端的结合，使探针对DNA聚合酶的引物独立性5’ 一 3’核酸酶活性具有抵抗性。在没有引物的帮助下，利用对于通过探针的改性得以调节的DNA聚合酶的引物独立性5’ 一3’核酸酶活性的敏感度或抵抗性的反应能够通过追加性的研究及开发，适用于固相中的靶检测。在本专利技术所属
中，出现了对于新的DNA微陈列技术研发的要求，该新的DNA微陈列技术能够克服与现有的DNA的微陈列方法相关的问题，并且在一个DNA微陈列上，能更加便捷并具有可靠性及再现性地检测靶序列，优选为多个靶序列。而且，在靶核酸序列的定量分析领域中还需要以实时方式在固相中实施反应，并对信号进行检测的新的实时微陈列方法。在本说明书全文中参照多篇专利及文献，并用括号来表示其引用部分。这样的专利及文献，作为参照全部包括在本说明书中，因此，能够更加明确地说明本专利技术所属的
的水准及本专利技术的内容。
技术实现思路
在此情况下，本 专利技术者精心研究、努力研发一种新的靶检测技术，上述技术利用具有相互作用性双重标记的探针，以更加便捷的方式，在没有假阳性及假阴性结果的情况下，对革G核酸序列进行检测、识别及定量。本专利技术者对双重标记探针上的标记的结合位点及模式进行多种调节。有趣的是，本专利技术者发现了 DNA聚合酶对引物独立性5’ 一 3’核酸酶活性的碱基标记核苷酸抵抗性，并且，发现了一种能够有效适用于靶核酸序列检测的双重标记探针上的标记的结合位点及模式，这在双重标记中，第一标记与探针的5’ -末端相结合，第二标记与位于第一标记的下游的核苷酸碱基相结合。本专利技术的独特的标记方式诱导探针使其根据靶核酸序列的存在与否来产生信号(包括信号的产生、增加及减少)，而且对DNA聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性具有抵抗性。本专利技术的内部阻断双重标记探针(internally blocked dual-labeled probe)可自由决定内部标记(即，第二标记)的位点，并且，在没有假阳性及假阴性数据的情况下，能够有再现性地从固相基质上最终残留的标记中获得信号。本专利技术者判断，本专利技术利用探针在固相基质上对靶核酸序列进行检测时，提供最优化的实验方案。因此，本专利技术的目的在于，提供一种在固相利用对于DNA聚合酶的5’ 一 3’外切核酸酶活性的抵抗性，检测靶核酸序列的方法。本专利技术的再一目的在于，提供一种在固相利用对于DNA聚合酶的5’ 一3’外切核酸酶活性的抵抗性，从DNA或核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒。本专利技术的另一目的在于，提供一种将对于DNA聚本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：千钟润，
申请(专利权)人：SEEGENE株式会社，
类型：
国别省市：