利用夹紧探针及检测探针的多靶核酸检测方法的应用技术

本发明专利技术涉及利用夹紧探针及检测探针的靶核酸检测方法的应用，本发明专利技术可通过抑制野生型基因或不必要的基因的扩增，并选择性地扩增及检测所要检测的极微量的靶基因，来有效地检测试样内所包含的微量的变异或特定基因序列。并且，可通过熔解曲线分析来同时辨别多种基因型。尤其，可使用为通过被确认为高检测敏感度的极少量的突变基因型来辅助疾病的医学病态的诊断、预后、监测、治疗功效的评价、核酸及蛋白质转导研究的方法等。本发明专利技术包括利用组织等侵袭性标本和非侵袭性标本(血液、小便、痰、大便、唾液、细胞)来检测表皮生长因子受体EGFR、克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物KRAS、神经母细胞瘤病毒癌基因NRAS等生物标志物并评价生物标志物的突变的存在的步骤，上述生物标志物及突变的存在提供用于在相关疾病的生命周期检测、疾病的预后、预测、决定疾病的治疗方针、疾病的诊断/早期诊断、疾病的预防、疾病治疗剂的开发中利用的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用夹紧探针及检测探针的靶核酸的检测方法及应用，随着迅速并敏感地检测基因试样所包含的微量的突变，可用在多种用途，尤其可向基因突变检测方法及对基因突变相关疾病的诊断或研究提供所需的多种信息。并且，本专利技术涉及敏感地检测基因内微量含有的突变，由此辅助疾病或医学病态的诊断、预后、疾病的监测、治疗功效的评价、核酸及蛋白质信号转导研究等的方法。并且，本专利技术涉及在对象中监测各种疾病(例如，癌)的发作的方法及监测复发的方法。
技术介绍
随着执行基因检查，可在具有疾病症状的患者中确诊或鉴别有所怀疑的遗传病。并且，也可通过检查是否存在引起疾病的基因的突变来预测提高疾病的发病可能性和危险度的疾病。在报告中指出，这种基因型的检查可有助于疾病的预防、早期诊断、治疗及管理，从而减少疾病的发病率和死亡率。这种基因检查以人体内的所有细胞在遗传方面相同为前提，可以利用人体的任何组织进行基因检查，但最容易的方法为在血液中提取脱氧核糖核酸(DNA)来使用。多种试样可以为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、染色体、代谢物质等。尤其，随着查明肿瘤基因(Oncogenes)的变异(mutations)、肿瘤抑制基因(tumorsuppressorgenes)的变异、反常(deregulations)和染色体的异常(chromosomalabnormalities)等基因的异常干涉癌症的专利技术和药物的预后判断的事实，报告出多种研究(FearsonERetal.,Cell.,1990；K.WKinzleretal.,Cell.,1996；ManuelSerranoetal.,Cell.,1997；AmadoRGetal.,J.Clin.Oncol.,2008,RaponiMetal.,Curr.Opin.Pharmacol.,2008；SienaSetal.,J.Natl.CancerInst.,2009)。可通过对特异性基因的分析来间接地确认是否存在癌症的发病。例如，具有表皮生长因子受体(EGFR)核酸的相对增加，例如，具有如p53等肿瘤抑制基因的相对减少等。并且，在肿瘤基因的功能和癌症的相关性及药物反应性等报告中提出肿瘤基因的突变检查的必要性。例如，有报告指出，若在结肠癌中频频观察得到的克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)外显子2(密码子12、密码子13)基因的突变检查后，向正常的克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物患者投用作为抗表皮生长因子受体抗体(anti-EGFRantibody)治疗剂的西妥昔单抗(cetuximab)，则反应率为35～45％左右(Lievreetal.CancerRes2006；66：3992-3995)，且在用于确认其他变异型大鼠肉瘤(RAS)的研究中，克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物外显子2(密码子12、密码子13)的变异率为40～45％，在克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物外显子2为正常的情况下，克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物密码子61、密码子146、神经母细胞瘤病毒癌基因(NRAS)密码子61、密码子12、密码子13等的变异率为约15～20％，因此，若检查癌除基因外显子2之外的其他大鼠肉瘤突变，则大鼠肉瘤变异率增加(Douillardetal.NEnglJMed.2013)。在癌症的治疗中，以第一次抗癌化学疗法剂决定适当的药物极为重要。在大肠癌的情况下，在推出生物药剂(Biologicagent)之前，以投用FOLFOX6(氟尿嘧啶(fluoropyrimidine)、亚叶酸钙(leucovorin)、奥沙利铂(oxaliplatin))或FOLFIRI作为第一次治疗剂，并投用FOLFIRI或FOLFOX6作为第二次治疗剂的两种方法(Tournigand,etal.JCO2004)进行治疗。然而，随着开发作为靶向治疗剂的贝伐单抗(bevacizumab)和西妥昔单抗(cetuximab)，当进行第一次治疗时，在向FOLFIRI追加贝伐单抗的情况下，已证明出具有生存期间延长效果，在晶体(CRYSTAL)研究中，若向正常的克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因患者并用FOLFIRI和西妥昔单抗，则呈现出生存期间延长的效果(VanCutsem,JClinOncol.2011)。并且，与多种靶向治疗剂的开发一同报告出可预测这些药剂的反应的因子的研究。代表性地，涉及表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体和克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)基因的突变，表皮生长因子受体由于可通过克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物信号转导体系来促进细胞的生长和转移，因此在克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物信号转导体系出现异常的情况下，即，在克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物或鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌性同源体B1(BRAF)发生突变的情况下，可减少阻断表皮生长因子受体的效果。实际上，报告中指出，克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突变和鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌性同源体B1突变为可预测减少如西妥昔单抗或帕尼单抗(panitumumab)的表皮生长因子受体单克隆抗体的治疗效果的标志物(EberhardDAJClinOncol,2005/KarapetisCS,NEnglJMed,2008/DiNicolantonioFJClinOncol,2008)。与此相关，在对阿斯利康制药有限公司(Astrazeneca)的吉非替尼(gefitinib)单一疗法的2期研究资料的小组分析资料中，证明出对吉非替尼表现出释放学性反应的患者的临床特性为女性、非吸烟者、腺癌及东洋人的事实，而且这种结果在之后的厄洛替尼(erlotinib)研究资料中也表现出出奇的一致的结果。并且，在BR.21的研究结果中也可观察到与厄洛替尼反应相关的临床要素中，在腺癌、非吸烟者、东洋人中存在类似的生存资料的差异。基于这种临床资料，提出在与表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-KTI)发生反应的小组患者中存在可说明原因的某种分子机制的假设，且在假设癌基因依赖(oncogeneaddiction)的条件下，对表皮生长因子受体基因的碱基序列进行解读后发现表皮生长因子受体发生突变。虽然已知在多种肿瘤(乳腺癌、神经胶质瘤、前列腺癌等)中，表皮生长因子受体发生突变，但其位置发生在大部分细胞外结构域(domain)中，也与表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂的反应无关。相反，在决定表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂反应的突变确认结果，确认表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂在用于决定在细胞内产生作用的酪氨酸激酶结构域(tyrosinkinasedomain)的外显子内产生，且确认这些为与腺嘌呤核苷三磷酸结合袋(ATP-bindingpocket)或活性环(activationloop)相关的突变。表皮生长因子受体-酪氨酸激酶结构域(EGFRtyrosinekinasedomain)由七个外显子(18～24)构成，但大部分的表皮生长因子受体突变位于外显子18～21且分为如下三种类型。外显子19的缺失(deletion)占60％，外显子21的错义突变(L858R，missensemutation)占25％，剩余的很罕见，但为外显子18、外显子20、外显子21的点突本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用探针混合体的检测方法，作为为了癌症的诊断、预防、治疗或预后估计而从患者的试样中检测表皮生长因子受体或克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变的方法，其特征在于，上述探针混合体包括：一个以上的检测探针，用于检测表皮生长因子受体或克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变；以及夹紧探针，用于抑制野生型表皮生长因子受体基因及野生型克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因的扩增。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.25 KR 10-2014-00950501.一种利用探针混合体的检测方法，作为为了癌症的诊断、预防、治疗或预后估计而从患者的试样中检测表皮生长因子受体或克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变的方法，其特征在于，上述探针混合体包括：一个以上的检测探针，用于检测表皮生长因子受体或克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变；以及夹紧探针，用于抑制野生型表皮生长因子受体基因及野生型克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因的扩增。2.一种利用探针混合体的检测方法，作为为了提供对癌症的酪氨酸激酶抑制剂给药治疗所需的信息而从患者的试样中检测表皮生长因子受体或克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变的方法，其特征在于，上述探针混合体包括：一个以上的检测探针，用于检测表皮生长因子受体或克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变；以及夹紧探针，用于抑制野生型表皮生长因子受体基因及野生型克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因的扩增。3.一种利用探针混合体的检测方法，作为为了提供对癌症的西妥昔单抗或帕尼单抗的治疗所需的信息而从患者的试样中检测克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变的方法，其特征在于，上述探针混合体包括：一个以上的检测探针，用于检测克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变；以及夹紧探针，用于抑制野生型克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因的扩增。4.根据权利要求1至3中任一项所述的利用探针混合体的检测方法，其特征在于，癌症选自由肺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌、胃肠癌、头颈癌，非小细胞肺癌、神经癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、生殖道癌、胆囊癌、黑素瘤及白血病组成的组中。5.根据权利要求1至3中任一项所述的利用探针混合体的检测方法，其特征在于，患者的试样选自由血液、血清、血浆、淋巴、母乳、小便、粪便、眼内液、唾液、精液、脑提取物、脊髓液、阑尾、脾脏及扁桃体组织提取物组成的组中。6.根据权利要求1至3中任一项所述的利用探针混合体的检...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔在真，尹志惠，金秀南，金成基，金镇羽，
申请(专利权)人：帕那金股份有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR