一种基于Ion Torrent测序平台的靶向叶绿体测序方法技术

本发明专利技术公开一种基于Ion Torrent测序平台的靶向叶绿体测序方法，包括以下步骤：以新鲜的叶片为材料，切片并染色，采用激光显微切割捕获叶绿体，并提取叶绿体DNA，进行PCR扩增及产物检测，并对其进行文库构建及质检，Ion Torrent上机测序及结果分析。本发明专利技术所述方法设计严谨、流程简单，检测结果精准可靠，完全去除基因组的污染问题，最大程度的降低了叶绿体序列的分析难度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体地说是涉及一种基于IonTorrent测序平台的靶向叶绿体测序方法。
技术介绍
叶绿体是绿色植物进行光合作用和能量转化的重要细胞器。1909年，Baur和Correns通过在三种枝条颜色不同的紫茉莉之间进行杂交，发现其叶片花斑性状不符合孟德尔遗传现象，推测叶绿体内存在遗传物质。叶绿体DNA大部分都是共价、闭合的双链环状分子，少数为线状分子，叶绿体DNA大小一般在120kb-160kb之间，而藻类中叶绿体DNA大小差异很大。自1986年第一条完整叶绿体发表以来，叶绿体基因组的研究备受关注。叶绿体基因工程以及系统发育是其主要的研究方向，并且已被广泛用于叶绿体转化技术及植物亲缘关系鉴定的基础和应用研究。叶绿体基因组研究除了对于揭示叶绿体DNA的结构、起源、物种亲缘关系、植物多样性等具有重要意义，更重要的是叶绿体基因组研究还可以推动植物在分子育种、遗传转化等叶绿体基因工程方面的研究进程。目前的叶绿体序列检测的方法主要有基于第一代测序技术的方法和基于第二代测序技术的方法，但是无论应用哪种方法，基因组的污染对叶绿体序列后续分析是一个很大的难题，因此一种特异性靶向叶绿体序列检测及分析技术势在必行。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种精准、快速、流程简单的检测叶绿体DNA序列的方法。本专利技术的技术方案如下：一种基于IonTorrent测序平台的靶向叶绿体测序方法，包括以下步骤：步骤a、制备样本切片并染色，涂片染色方法包括HE染色、健那绿染色；步骤b、激光显微切割捕获叶绿体，通过激光显微切割捕获的叶绿体组织的数量为1-200个；步骤c、提取出DNA；步骤d、PCR扩增及产物检测；步骤e、对扩增好的产物进行文库构建及质检，所述文库构建包括DNA超声波打断；末端修复和纯化DNA；连接接头和纯化连接的DNA：文库扩增、纯化及质控；步骤f、采用IonTorrent测序平台上机测序及分析结果，将制备好的文库在Lifetechnologies公司的IonTorrent高通量测序仪上进行测序，读长250bp，要求测序深度达到3000×，每个样本产生约90M的数据量；测序数据经过信息分析得到叶绿体全基因组序列资料，与叶绿体参考序列比对，即可获得样本叶绿体序列变异信息，包括点突变、缺失、插入等变异情况。优选地，所述通过激光显微切割捕获的叶绿体组织的数量为20-50个。本专利技术的有益效果是所述基于IonTorrent测序平台的靶向叶绿体测序方法通过特异性染色技术，将叶绿体组织着色，利用激光显微切割技术，靶向获取叶绿体基因组，靶向获得叶绿体组织，彻底去除基因组，通过微量DNA提取、扩增技术，得到叶绿体基因组并用于下游的文库构建及检测；同时配合使用Lifetechnologies公司的IonTorrent个人化操作基因组测序仪，它是市场上相较其他测序技术，更简单，经济和具有强大的可扩展性的测序平台，可得到大量高质量的测序数据，测序的深度保证了结果的准确性；本专利技术所述方法设计严谨、流程简单，检测结果精准可靠，完全去除基因组的污染问题，最大程度的降低了叶绿体序列的分析难度。附图说明图1是本专利技术所述基于IonTorrent测序平台的靶向叶绿体测序方法的步骤流程图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。如图所示，本专利技术公开一种基于IonTorrent测序平台的靶向叶绿体测序方法，包括以下步骤：步骤a、制备样本切片并染色，涂片染色方法包括HE染色、健那绿染色；步骤b、激光显微切割捕获叶绿体，通过激光显微切割捕获的叶绿体组织的数量为1-200个；优选数量为20-50个；步骤c、提取出DNA；步骤d、PCR扩增及产物检测；步骤e、对扩增好的产物进行文库构建及质检，所述文库构建包括DNA超声波打断；末端修复和纯化DNA；连接接头和纯化连接的DNA：文库扩增、纯化及质控；步骤f、采用IonTorrent测序平台上机测序及分析结果，将制备好的文库在Lifetechnologies公司的IonTorrent高通量测序仪上进行测序，读长250bp，要求测序深度达到3000×，每个样本产生约90M的数据量；测序数据经过信息分析得到叶绿体全基因组序列资料，与叶绿体参考序列比对，即可获得样本叶绿体序列变异信息，包括点突变、缺失、插入等变异情况。实施例一采用本专利技术的基于IonTorrent测序平台的靶向叶绿体测序方法进行荷叶的叶绿体测序步骤a、叶子制备样本切片并染色，涂片染色方法包括HE染色、健那绿染色；具体操作方法为：首先将叶子放清水中浸泡30分钟，待叶片舒展开并吸足水分；然后选择一些叶片，进行徒手切片；接着进行健那绿染色，利用1％健那绿染液，将叶子切片染色；步骤b、激光显微切割捕获叶绿体，通过激光显微切割捕获的叶绿体组织的数量为1-200个；具体操作方法为：首先激光显微切捕获细胞质，将玻片置于显微切割仪的载物台上相应位置，10倍镜下寻找细胞汇集区，将该区域设置为切割目标范围，在高倍镜下，精准切割蓝绿色的叶绿体；切割完毕后，下降玻片上方的ep管盖至膜片切割部位表面，吸附切割目标，完成一次切割，重复操作5-50次，完成线粒体的收集；切割完毕后，盖上ep管，4℃保存；步骤c、提取出DNA；利用磁珠提取DNA，提取切割得到的叶绿体样本DNA基因组；步骤d、PCR扩增及产物检测；利用微量样本DNA扩增试剂盒(QIAGEN)，将提取的DNA基因组产物扩增；利用磁珠进行PCR产物纯化；利用Qubit检测纯化产物浓度，进行PCR产物质检；步骤e、对扩增好的产物进行文库构建及质检，所述文库构建包括DNA超声波打断；末端修复和纯化DNA；连接接头和纯化连接的DNA：文库扩增、纯化及质控；首先，利用超声打断仪，将叶绿体基因组DNA随机打断，条带小于800bp，主带集中在300bp；再利用磁珠法，将片段纯化；利用“DNASeqLibraryPreparationKit”，完成叶绿体DNA文库的构建，具体流程包括：末端修复及纯化；两端加街头及纯化；文库扩增及纯化；利用Qubit检测线粒体DNA基因组文库的浓度；步骤f、采用IonTorrent测序平台上机测序及分析结果，将制备好的线粒体DNA文库，在Lifetechnologies公司的IonTorrent高通量测序仪上进行测序，读长250bp，要求测序深度达到3000×，每个样本产生约90M的数据量；将读段拼接成scaffolds；拼接后的片段与紧源参考叶绿体基因组做对比，将拼接得到的scaffolds定位；然后补GAP：GAP的上下游序列区域设计引物，以样本全基因组为摸板，进行PCR扩增并测序；对叶绿体基因组做注释和进化分析，测序数据经过信息分析得到叶绿体全基因组序列资料，与叶绿体参考序列比对，即可获得样本叶绿体序列变异信息，包括点突变、缺失、插入等变异情况。本专利技术的基于IonTorrent测序平台的靶向叶绿体测序方法通过特异性染色技术，将叶绿体组织着色，利用激光显微切割技术，靶向获取叶绿体基因组，靶向获得叶绿体组织，彻底去除基因组，通过微量DNA提取、扩增技术，得到叶绿体基因组并用于下游的文库构建及检测；同时配合使用Lifet本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于Ion Torrent测序平台的靶向叶绿体测序方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤a、制备样本切片并染色，涂片染色方法包括HE染色、健那绿染色；步骤b、激光显微切割捕获叶绿体，通过激光显微切割捕获的叶绿体组织的数量为1‑200个；步骤c、提取出DNA；步骤d、PCR扩增及产物检测；步骤e、对扩增好的产物进行文库构建及质检，所述文库构建包括DNA超声波打断；末端修复和纯化DNA；连接接头和纯化连接的DNA：文库扩增、纯化及质控；步骤f、采用Ion Torrent测序平台上机测序及分析结果，将制备好的文库在Life technologies公司的Ion Torrent高通量测序仪上进行测序，读长250bp，要求测序深度达到3000×，每个样本产生约90M的数据量；测序数据经过信息分析得到叶绿体全基因组序列资料，与叶绿体参考序列比对，即可获得样本叶绿体序列变异信息，包括点突变、缺失、插入等变异情况。

【技术特征摘要】
1.一种基于IonTorrent测序平台的靶向叶绿体测序方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤a、制备样本切片并染色，涂片染色方法包括HE染色、健那绿染色；步骤b、激光显微切割捕获叶绿体，通过激光显微切割捕获的叶绿体组织的数量为1-200个；步骤c、提取出DNA；步骤d、PCR扩增及产物检测；步骤e、对扩增好的产物进行文库构建及质检，所述文库构建包括DNA超声波打断；末端修复和纯化DNA；连接接头和纯化连接的DNA：文库扩增、纯化及质控；步骤f、采用IonTorrent测序平...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵晓芳，吴卫卫，曹红，朱天媛，侯正强，
申请(专利权)人：江苏苏博生物医学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32