一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术制造技术

本发明专利技术公开了一种新型的靶向核酸分子的捕获与富集技术，靶向核酸分子片段通过与特异的捕获探针杂交，而标记有丙烯酰胺基团的探针分子被固定在丙稀酰胺胶中，从而将靶向核酸分子片段捕获下来。该技术可用于微生物群落功能基因捕获与高通量测序分析，人类基因组中疾病相关基因的钓取与高通量测序分析，环境病原微生物特征序列钓取与分析；另外，还可用于多种分子疾病与病原微生物诊断试剂盒的开发。本发明专利技术成本较低，并且丙烯酰胺分子胶连效率远远高于磁珠与探针之前的连接效率，因此捕获效率也大大提高。

【技术实现步骤摘要】
一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种核酸分子的捕获与富集技术。
技术介绍
新一代高通量测序仪的出现大大降低了核酸测序成本，采用高通量测序仪，短短几年内测序了大量的核酸序列，多种生物的全基因组被测序，很多个人基因组也得到测序。人类全基因组测序是高通量测序仪重要的应用。但是，多数研究与诊断目标只需要测序大量样本中的某一特定片段。例如，对于人类基因组来说，外显子是蛋白质编码区域，而外显子只占全基因组的大约1%。大部分情况下，特别是对于疾病相关外显子突变的筛选，只测外显子区域就足够了。另外，越来越多的研究发现，微生物群落的宏基因组功能基因的分析与多种人类重大疾病、环境污染、大气温室效应等密切相关，而宏基因组是一个非常庞大的数据，人类肠道微生物群落宏基因组是人类基因组的100倍，不同人、同一个人不同的生理时期都具有不同的微生物群落组成，但在这些庞大的微生物群落中，起到关键作用的往往只有部分功能基因，对于一个微生物群落，只需要对少量的功能基因进行测序就可以达到分析的目的。大量分子进行靶向平行分析，需要发展核酸捕获技术，目前已有报导和市场化捕获产品主要有两种，第一种是基于高通量杂交分析芯片的捕获与富集。这种方法首先是成本较高。高通量杂交芯片本身是一个非常昂贵的技术，某些芯片杂交分析成本高于目前的高通量测序分析成本，如果以这种昂贵的芯片进行富集与捕获目标分子，然后再进行测序分析，成本较高；采用高通量芯片进行捕获与富集目标分子的第二个弊端是捕获效率较低，芯片与捕获片段杂交的方式是固相杂交，固相分子杂交的杂交效率较低。目前市场上第二种捕获方法是基于液相分子杂交与磁珠分尚方法，该方法首先进行一步液相杂交，然后将探针上标记的一个基团与磁珠 上的一个特异基团共价连接，将捕获分子与磁珠连接在一起，磁珠通过磁场的作用，将捕获片段与非特异片段分离出来。该方法与第一种方法相比，捕获效率与成本都得以降低。但是，由于该方法需要一步共价连接，连接效率直接影响着捕获与富集产率，另外，由于探针标记价格较高，所以捕获成本仍然较高。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术。本专利技术采用的一个技术方案是: 提供一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，包括以下操作步骤: 1)将待捕获核酸分子片段化，切胶回收200bp-500bp的核酸分子片段，连接通用接头，形成靶向核酸分子片段； 2)将步骤I)的靶向核酸分子片段与捕获探针及杂交液混合，完成杂交反应，所述捕获探针修饰有丙烯酰胺化学基团；3)向步骤2)形成的混合溶液中加入丙烯酰胺贮存液、过硫酸铵和TEMED，形成丙烯酰胺溶液，并将所述丙烯酰胺溶液置于丙烯酰胺胶成型装置的一端，待完全凝固后形成丙烯酰胺胶，并在所述丙烯酰胺胶成型装置的两端充入导电胶体； 4)将经步骤3)之后的丙烯酰胺胶置于电泳槽的TBE电泳液中，电泳去除其中的非特异片段； 5)将经步骤4)反应之后的丙烯酰胺胶置于变性电泳溶液中，变性电泳将靶向核酸分子片段与捕获探针分离，并且所述靶向核酸分子片段随电流集聚在一段导电胶体中； 6)收集步骤5)中导电胶体中的靶向核酸分子片段，进行高通量测序分析。在本专利技术一个较佳实施例中，所述待捕获核酸分子是单双链线形或单双链环形的DNA 或 RNA。在本专利技术一个较佳实施例中，所述捕获探针是单链DNA、RNA、PNA或LNA。在本专利技术一个较佳实施例中,所述捕获探针5’端、3’端或任意碱基上修饰任意个数的丙烯酰胺化学基团。在本专利技术一个较佳实施例中，步骤3)中所述丙烯酰胺贮存液中丙烯酰胺与N, N ;-亚甲双丙烯酰胺的质量比为19:1或29:1。在本专利技术一个较佳实施例中，所述丙烯酰胺胶成型装置为非导电材料制成，包括塑料软管、玻璃沟槽或玻璃管。在本专利技术一个较佳实施例中，所述丙烯酰胺溶液质量体积比浓度为2%_6%。`在本专利技术一个较佳实施例中，所述丙烯酰胺胶成型装置的两端充置的导电胶体为任意导电的、对核酸分子有过滤或吸附作用的材料。在本专利技术一个较佳实施例中，所述导电胶体为琼脂糖胶。在本专利技术一个较佳实施例中，步骤5)中的所述变性电泳溶液为碱性溶液，包括NaOH溶液、KOH溶液或Ca (OH) 2溶液。本专利技术的有益效果是: (I)本专利技术一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，采用大量捕获探针与靶向核酸分子片段结合，并将捕获探针固定在丙烯酰胺胶上，通过跑胶去除其中的非特异片段，靶向核酸分子片段又可以通过变性电泳方法将其收集起来，使得靶向核酸分子片段得以富集，然后进入下一步的测序分析。微生物群落宏基因组庞大，本专利技术针可对感兴趣的基因或片段进行富集，并进一步的分析。(2)本专利技术一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，采用的杂交体系为溶液内杂交，然后将杂交分子固定，以提高捕获探针与靶向核酸分子片段的杂交效率。以往的研究报导，核酸分子捕获多采用固液相分子杂交技术，也就是将探针分子固定在固相载体上，然后将被捕获分子与探针杂交，被杂交捕获的分子留下来进一步检验分析，没有被杂交上去的分子被冲洗去除。相对于固液相分子杂交技术，液相分子杂交大大提高了分子之间的碰撞机会，提高分子之间的杂交效率，进一步提高了核酸分子的检测灵敏度，也提高了病原微生物的检测灵敏度。(3)本专利技术一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，采用丙烯酰胺胶固定捕获探针与祀向核酸分子片段的杂交体，胶体对核酸分子的固定量较大，因此捕获效率闻。胶体内的探针固定量可达8μΜ，我们多用的PCR弓丨物浓度为0.4 μΜ，胶体有这么高的固定容量，多数探针及杂交体都被固定下来，因此具有较高的固定效率。目前，唯一采用溶液杂交的捕获技术，是采用磁珠固定探针与杂交体。磁珠连接亲合素，探针上连接生物素，这种亲和素与生物素的连接效率虽高，但磁珠上的亲合素(固相载体)与探针上的生物素(液相)之间的连接效率最高也只有30%的效率，多数杂交体无法因为连接不到磁珠上，而无法捕获下来。(4)本专利技术一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，可采用原位固相单分子扩增的方法来扩大待检测核酸分子的拷贝数，以提高了核酸分子捕获量。当宏基因组中靶向核酸分子片段较少时，本专利技术可以采用原位扩增的方法增加目标片段数量。核酸分子扩增效率与被扩增分子与引物分子之间的碰撞机会呈正相关，理论上，PCR扩增反应可以将溶液中的单个分子扩增出来，但实际实验操作过程中发现，PCR检测的灵敏度是大于10000个分子。本专利技术在进行单分子扩增之前，首先通过电泳或沉淀等技术将非目标片段去除，剩余的片段只有引物和目标分子，这样大大增加了目标分子与引物之前的碰撞机会，也大大提高了目标分子的扩增效率。(5)本专利技术一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，采用原位固相单分子扩增方法增加目标核酸分子捕获量，减少了核酸分子扩增的偏性，更宜于高通量测序定量分析目标片段的含量。常规的通用引物PCR扩增，由于模板分子序列及高级结构的不同，如GC含量低的片断较容易被扩增，因此在大量片断扩增过程中，最终的反应液中小片断和GC含量低的片断较多，而大片断与GC含量高的片断较少。扩增效率高的核酸模板分子会越来越多，而扩增效率低人模板分子增长速度会越来越小，最终采用基因芯片杂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，其特征在于，包括以下操作步骤：1）将待捕获核酸分子片段化，切胶回收200bp?500bp的核酸分子片段，连接通用接头，形成靶向核酸分子片段；2）将步骤1）的靶向核酸分子片段与捕获探针及杂交液混合，完成杂交反应，所述捕获探针修饰有丙烯酰胺化学基团；3）向步骤2）形成的混合溶液中加入丙烯酰胺贮存液、过硫酸铵和TEMED，形成丙烯酰胺溶液，并将所述丙烯酰胺溶液置于丙烯酰胺胶成型装置的一端，待完全凝固后形成丙烯酰胺胶，并在所述丙烯酰胺胶成型装置的两端充入导电胶体；4）将经步骤3）之后的丙烯酰胺胶置于电泳槽的TBE电泳液中，电泳去除其中的非特异片段；?5）将经步骤4）反应之后的丙烯酰胺胶置于变性电泳溶液中，变性电泳将靶向核酸分子片段与捕获探针分离，并且所述靶向核酸分子片段随电流集聚在一段导电胶体中；6）收集步骤5）中导电胶体中的靶向核酸分子片段，进行高通量测序分析。

【技术特征摘要】
1.一种新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，其特征在于，包括以下操作步骤: 1)将待捕获核酸分子片段化，切胶回收200bp-500bp的核酸分子片段，连接通用接头，形成靶向核酸分子片段； 2)将步骤I)的靶向核酸分子片段与捕获探针及杂交液混合，完成杂交反应，所述捕获探针修饰有丙烯酰胺化学基团； 3)向步骤2)形成的混合溶液中加入丙烯酰胺贮存液、过硫酸铵和TEMED，形成丙烯酰胺溶液，并将所述丙烯酰胺溶液置于丙烯酰胺胶成型装置的一端，待完全凝固后形成丙烯酰胺胶，并在所述丙烯酰胺胶成型装置的两端充入导电胶体； 4)将经步骤3)之后的丙烯酰胺胶置于电泳槽的TBE电泳液中，电泳去除其中的非特异片段； 5)将经步骤4)反应之后的丙烯酰胺胶置于变性电泳溶液中，变性电泳将靶向核酸分子片段与捕获探针分离，并且所述靶向核酸分子片段随电流集聚在一段导电胶体中； 6)收集步骤5)中导电胶体中的靶向核酸分子片段，进行高通量测序分析。2.根据权利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，其特征在于，所述待捕获核酸分子是单双链线形或单双链环形的DNA或RNA。3.根据权利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕获与富集技术，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：周东蕊，张红琳，章爱娣，肖鹏峰，白志茂，陆祖宏，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：