靶向基因DNA分子探针的制备方法技术

本发明专利技术公开了靶向基因DNA分子探针的制备方法，其将网路生物医学信息学和实验室分子生物学有机的结合起来，通过使用网路的或计算机的生物医学信息学工具，来确定人类基因组中疾病基因序列或正常基因序列，剔除其中的非特异的重复DNA片断，保留独特的和特异的疾病基因序列或者基因组特有的正常基因序列。整个DNA探针制作过程包括两大程序：第一程序是将基因的DNA序列确定并排除非特异性重复片段，第二程序是在第一程序的设计和指导下，应用实验室分子生物学的手段将此DNA探针实际地制造出来。本发明专利技术制造的探针可用于在福尔马林固定、石蜡包埋的组织和细胞切片以及细胞涂片的临床病理标本上进行以形态学为基础的原位杂交反应包括荧光原位杂交和非荧光的显色原位杂交，用于各级各类疾病基因的检测和诊断，还可用于正常人类基因和非人类基因的测定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学
，涉及将基于计算机的生物医学信息学和实验室分子生物学结合起来以制备靶向基因DNA分子探针的方法。
技术介绍
人类基因组测序工程于1990年正式启动，经过多个国家的数百名科学家和工程技术人员的共同努力，于2001年发表了初稿，并于2006年最后完成，历时十六年，耗资上百亿美元。这一工程的完工，将第一个也是最重要的一个哺乳动物，即我们人类自己的整个基因组的图谱展现在我们眼前，其中包括所有22对常染色体(1-22)和两个性染色体(X，Y)的DNA序列，共计大约32亿核苷酸碱基。同时揭示人类蛋白质编码的基因大约有二万至二万五千个，其核苷酸序列的总长度仅占整个基因组长度的1.9%。这些基因不均等地分散分布在基因组的各个角落，参见图I。此外，占基因组绝大部分的碱基是一些有序或无序的重复序列，有些重复序列具有明显的规律，比如，5-8个碱基循环出现构成到100-200个碱基的集团，然后这个集团又在不同的基因组中出现，由于此类DNA碱基可以在任意(无规律)基因组DNA中出现，如图2，因此，如果所制作的进行杂交的DNA分子探针中含有此类重复序列，则信号会在所有染色体基因或细胞中出现，所得结果就被混淆，这类杂交信号即被称为干扰信号或背景信号。因此，如何去除这些重复片段，成为一个问题。随着人类基因组测序工程的完成以及后基因组时代的到来，生物医学的科学研究和技术发展进入了一个前所未有的新时期，这对医疗保健的发展和进步提供了空前的机遇，对生物医学高科技的研究和应用也提出了巨大的挑战。生物医学基础研究也不再是一个独立的概念，而是时时刻刻都与医疗保健相关联。如何将基础研究的成果用于临床？如何开展具有明确医药用途的科学研究即基础与临床转化性的研究(transitionalresearch) 是目前每一位生物医学研究人员都在考虑的问题。由于基因的异常与多种疾病都相关，例如肿瘤，心血管疾病，遗传病，中枢神经退行性疾病，视网膜黄斑变性，血液病，代谢营养性疾病，自体免疫性疾病，内分泌性疾病如糖尿病，等等。另外，对于传染性疾病，如病毒，细菌感染，也要研究其基因结构，表达方式及蛋白产物，才能深刻地理解疾病的发生，发展和转归，才能进行更好的治疗，又如爱滋病(人类免疫缺陷病毒，Human immunodeficient virus, HIV),乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV),结核病(tuberculosis, TB)等等。在疾病的诊断上，用基因及其产物进行诊断，包括肿瘤(人类基因)和感染性疾病(微生物基因)，已显现广阔的应用前景。其结果更加准确，迅速，安全，可靠。基因诊断亦称分子诊断，是由人类基因组序列工程与其它致病性病源微生物和病源体的基因序列弄清楚以后所衍生出来的诊断领域，其历史虽然不长，已显示出强大的生命力。其发展速度非常快，其范围也囊括几乎所有医学领域。目前临床上已在使用的，以感染性疾病，肿瘤及心血管疾病最多。其中肿瘤病理学的“分子诊断”是一个重要的分支。根治肿瘤仍然是一世界性难题，但针对致癌基因的“靶向治疗”是目前最有效的肿瘤治疗战略之一。配合靶向治疗的“伴侣诊断”是目前国际上最新的肿瘤分子诊断方法。它通过对疾病分子标志物进行检测，对靶向治疗中病人的筛选及预后的观察起关键性作用。在过去的60年里，有关DNA的技术层出不穷，使得对DNA的检测成为可能，比如于1969年专利技术的荧光原位杂交(FISH)技术(Gall and Pardue，PNAS 1969)，1972年专利技术的分子克隆技术(Cohen, Chang and Hsu, PNAS 1972)以及 1985年专利技术的PCR技术(Saiki RK etal, Science 1985; Jeffreys, Wilson and Thein, Nature 1985)等等。此外，伴随人类基因组测序工程的进展，为了能够充分的分析，研究，分享和应用DNA序列的成果，计算机软件及基因网络系统得到了很好的开发。比如，1990年专利技术的基础局部搜索DNA同源序列的工具-比较基因组学的关键技术BLAST (Altschul SF et al, J. Mol. Biol. 1990)和2002年开始运行的UCSC基因组浏览器(Kent WJ and Colleagues, Genome Res. 2002)，都是很好的研究应用工具。这使得任何研究人员都能够再次利用并开发和发展DNA序列，并将其用到实际应用当中。本专利技术的靶向基因DNA分子探针的制备方法就是在分析，比较和应用以上这些技术的基础上诞生的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供将基于计算机的生物医学信息学和实验室分子生物学结合起来来制作具有特异性序列的DNA分子探针的方法，制备出的DNA分子探针能够与整个靶向基因的所有特异性DNA序列进行DNA-DNA杂交，起到准确探测、识别疾病基因和正常基因的作用。DNA分子探针的制备方法包括两大程序_6] 第一程序利用基于计算机的生物信息学手段来获得靶向基因的特异性DNA序列，并设计出相应PCR引物第一程序包括以下步骤(I)在公共基因库上搜索到靶向基因的基因组位置，然后识别出该靶向基因的编码序列和非编码序列(即外显子和内含子的区域)，剔除掉其中的非特异性重复序列，获得覆盖整个靶向基因的特异性DNA序列，该特异性DNA序列为不连续的多个DNA片段；位于外显子的编码序列一般都是特异性序列，即该基因所特有的(在少数情况下，有些基因的外显子编码序列也会与其同一家族的其它基因序列有非常大的同源性，应有所注意，在设计探针时因避免使用)。位于内含子的非编码序列又分成特异性序列和非特异性序列，前者是该基因所特有的，在制作探针时应当保留，后者一般由有序或无序的重复DNA序列构成，在制作DNA探针时应当去除。下面列出的一些重复序列，在基因组的许多基因内含子的区域中都存在，应当避免用在探针里。重复序列I : tgaatttcccagcctccagaactatgggaaataaatttctgttgtttacaagtaaatcattttatgttattttgttacagaagcccaaaaagatgaagacatacaccagatcactccattctcttcttgcttgcatggtttctgaggatacgttggatgtaattctaatattctctataggtattttctttatggctcct重复序列2 aagctccagtatacctaaacaagtgcaaatttgtttaagtacagttatttgtggtagcattagtcattgttttcaatagcaagaagaaaaaggaaacaac重复序列3 catcaaaaatcggttaccataaaatcctaatagttgaagagatgtaatttcaattatttggtaaacctgaccttcattgtcaaagc重复序列4 ttttcctgtgtctctgcaaccacaggcccctctcctttctcttaataaagataccagtcattgagtttgaaaattgctaagagagtctgttgtaaatctt重复序列5 cttagcacaaaaaaaaatgacagatatgtga本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向基因DNA分子探针的制备方法，其特征在于：包括第一程序，其利用基于计算机的生物信息学手段来获得靶向基因的特异性DNA序列，并设计出相应PCR引物；第二程序，其根据第一程序的设计应用分子生物学手段来制造DNA分子探针；所述第一程序包括以下步骤：（1）在公共基因库上搜索到靶向基因的基因组位置，然后识别出该靶向基因的编码序列和非编码序列，剔除掉其中的非特异性重复序列，获得覆盖整个靶向基因的特异性DNA序列，该特异性DNA序列为不连续的多个DNA片段；（2）给靶向基因的特异性DNA序列中每一个DNA片段设计出成对PCR引物，引物长度为18?25个碱基；所述第二程序包括以下步骤：（1）以正常组织的基因组DNA为模板，利用第一程序的步骤（2）中设计出的PCR引物，用PCR方法扩增出第一程序的步骤（1）中确定的靶向基因的特异性DNA序列，扩增出的特异性DNA序列含有靶向基因的所有特异信息；（2）利用扩增出的特异性DNA序列制造特异性的DNA分子探针，该DNA分子探针能够与整个靶向基因的所有特异性DNA序列进行DNA?DNA杂交。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：方园，
申请(专利权)人：张家港蓝苏生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：