本发明专利技术公开了一种线粒体靶向pH的比率型荧光探针制备方法和应用，该荧光探针的化学结构式如(1)所示：本发明专利技术公开的线粒体靶向pH比率型荧光探针,其合成方法简单，高灵敏度；检测方法受荧光探针浓度、微环境以及成像参数等因素的影响小；对各种金属阳离子、阴离子和生物氨基酸无响应，对pH微小变化敏感；在生物化学等检测领域具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学
，具体涉及一种线粒体靶向pH的比率型荧光探针制备方法和应用。
技术介绍
荧光分子探针能够将分子识别的信息转换成能被感知的荧光信号，具有灵敏度高、响应速度快、选择性高、检出限低、操作简单、分析成本低等优势，而且基于荧光的化学传感器具有可以对单(多)种对象进行实时、在线检测等特点，因而成为分析化学的研究热点；其中，比率型分子荧光探针受检测物浓度变化、光漂白、激发光强度等微环境影响小等优势，近年来在生物化学细胞检测中应用十分广泛，如细胞凋亡、细胞表面特征和细胞中pH实时检测等，对于某些疾病的分析诊断，了解细胞的某些机制具有重要意义。线粒体是绝大多数有氧代谢真核生物的脂质、糖类和氨基酸最终氧化和释放能量的主要场所，同时还具有细胞代谢、增殖、凋亡等信号传导与细胞周期调控等生理功能。研究显示，细胞和细胞器的许多重要生理过程等都与pH值密切相关。在正常的生理条件下，细胞外液中H+的浓度约为40nmol/L(pH=7.40),其变动幅度一般在0.1~0.2个pH单位。酸性和碱性过强会导致心、肺病变或神经类疾病，严重时甚至会有生命危险。因此，pH值的精确测量对线粒体的研究十分重要。目前，用于活细胞内线粒体靶向成像的荧光探针种类还不是很多；有的探针不仅合成步骤复杂，而且灵敏度不高。如中国专利CN105018074A；还有一些探针只能检测极端pH(pH2-4/10-12)，而在接近生理条件pH下无法检测，无法用于活细胞中pH的实时检测响应，如中国专利CN105548097A；因此，研发能够实时监控线粒体靶向在正常线粒体pH值附近变化的比率型荧光探针在生物化学领域具有重要意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种线粒体靶向pH的比率型荧光探针，能在细胞线粒体内靶向荧光成像。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种实时监控线粒体靶向pH的比率型荧光探针，所述的荧光探针的结构式为如(1)所示。一种线粒体靶向pH的比率型荧光探针制备方法和应用，所述的荧光探针制备方法包括以下步骤：步骤1.合成2-(苯并[d]噻唑-2-基)-6-甲基苯酚a.在圆底烧瓶中加入2-羟基-3-甲基苯甲酸、邻氨基苯硫酚和多聚磷酸，在搅拌条件下120℃反应4-6小时，然后150℃反应6-8小时；b.待步骤a中反应液冷却至室温后，将反应液倒入冰水中，再用饱和碳酸氢钠中和过量的多聚磷酸，过滤、水洗、干燥得目标化合物。步骤2.合成3-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-羟基-5-甲基苯甲醛①.在圆底烧瓶中加入乌洛托品、2-(苯并[d]噻唑-2-基)-6-甲基苯酚和乙酸或三氟乙酸，加热回流24-36小时；②.反应完成后，加水稀释，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤旋干溶剂得粗品，通过硅胶柱分离提纯得黄色固体目标化合物。步骤3.合成(E)-4-(3-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-羟基-5-甲基苯乙烯基)-1-甲基吡啶-1-鎓碘化物Ⅰ.在圆底烧瓶中，加入3-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-羟基-5-甲基苯甲醛、1,4-二甲基吡啶碘代物和催化量的哌啶或吡咯烷，搅拌下加热回流5-8小时；Ⅱ.将步骤Ⅰ中的反应液冷至室温，过滤，再用少量的乙醇洗涤滤饼，真空干燥得所述的比率型荧光分子探针，其结构式如(1)所示。一种实时监控线粒体靶向pH的比率型荧光探针应用，本专利技术的另一目的是荧光探针能够在细胞线粒体内实时检测pH的荧光显微成像应用。本专利技术的比率型荧光探针能快速定位于线粒体中实现pH荧光成像，具有较好的化学稳定性，能实现在BR缓冲液pH范围在4-10的比率型荧光成像，且对Ni2+,Co2+,Cu2+,Hg+,Ca2+,Zn2+,Pb2+,S2O82-Na+,Ru3+,Mg2+,Cr3+,Fe3+,Fe2+,H2O2,Ti3+,K+,Ag+,SO32+,Cys,GSH,Hcy,F-,Cl-,Br-,NO3-,NO2-,PO42-,CO32-等金属阳离子、阴离子以及生物体内相关氨基酸无响应，对pH具有高灵敏度，高选择性的优点，具有挺好的实际应用价值。附图说明图1为本专利技术的比率型荧光探针在不同pH值缓冲液中的紫外吸收光谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。图2为本专利技术的比率型荧光探针在不同pH值缓冲液中的荧光发射光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。图3为本专利技术的比率型荧光探针F575/F455比值随pH的变化图，横坐标为pH，纵坐标为波长575nm与波长455nm处的荧光强度比值。图4为本专利技术的比率型荧光探针与干扰离子在BR缓冲溶液的荧光强度F575/F455比值图，横坐标为探针与不同的分析离子，1.探针,2.Ni2+,3.Co2+,4.Cu2+,5.Hg+,6.Ca2+,7.Zn2+,8.Pb2+,9.S2O82-,10.Na+,11.Ru3+,12.Mg2+,13.Cr3+,14.Fe3+,15.Fe2+,16.H2O2,17.Ti3+,18.K+,19.Ag+,20.SO32-,21.Cys,22.GSH,23.Hcy,24.F-,25.Cl-,26.Br-,30.NO3-,31.NO2-,32.PO42-,33.CO32-，纵坐标为波长575nm与波长455nm处的荧光强度比值。图5为本专利技术的比率型荧光探针分子核磁氢谱图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步解释。本专利技术化合物合成方案如下所示。实施例1.合成2-(苯并[d]噻唑-2-基)-6-甲基苯酚a.在50mL单口圆底烧瓶中加入2.0g2-羟基-3-甲基苯甲酸、2g邻氨基苯硫酚和25mL多聚磷酸，溶解后，在搅拌条件下，升温至120℃反应4小时，然后升温至150℃继续反应7小时；b.待步骤a中反应完成，冷却至室温后，将反应液倒入冰水中。再用饱和碳酸氢钠中和过量的多聚磷酸，过滤、用水洗涤并干燥得白色产品2.7g。步骤2.合成3-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-羟基-5-甲基苯甲醛①.50mL单口圆底烧瓶中加入5.81g乌洛托品和2g2-(苯并[d]噻唑-2-基)-6-甲基苯酚，25mL三氟乙酸，加热回流28小时；②.反应完成后，加水稀释，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，将有机相旋干得1.8g粗品，通过硅胶色谱层析柱纯化得黄色产品1.60g。步骤3.合成(E)-4-(3-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-羟基-5-甲基苯乙烯基)-1-甲基吡啶-1-鎓碘化物①.100mL单口圆底烧瓶中，加入1.5g3-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-羟基-5-甲基苯甲醛和1.96g1,4-二甲基吡啶碘代物，加入6-8滴哌啶，加热回流反应5-8小时；②.待反应液冷至室温，过滤得到粗品，再用少量的乙醇洗涤，干燥得产品2.37g；1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.77(d,J=6.4Hz,2H),8.16(d,J=7.9Hz,1H),8.08(d,J=6.4Hz,2H),8.02(d,J=8.1Hz,1H),7.94(d,J=16.3Hz,2H),7.71(d,J=2.0Hz,1H),7.55(t,J=7.6Hz,1H),7.47(t,J=7.5Hz,1H),7.31(d,J=16.2Hz,1H),4.22(s,3H),2.28(s,3H)。实施例2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种线粒体靶向pH比率型荧光探针制备方法和应用，其特征在于,所述的比率型荧光探针的结构式为如(1)所示。
【技术特征摘要】
1.一种线粒体靶向pH比率型荧光探针制备方法和应用，其特征在于,所述的比率型荧光探针的结构式为如(1)所示。2.如权利要求1所述的比率型荧光探针的制备方法,其特征在于,其合成包括以下步骤：步骤1.合成2-(苯并[d]噻唑-2-基)-6-甲基苯酚a.在圆底烧瓶中加入2-羟基-3-甲基苯甲酸、邻氨基苯硫酚和多聚磷酸，在搅拌条件下120℃反应4-6小时，然后150℃反应6-8小时；b.待步骤a中反应液冷却至室温后，将反应液倒入冰水中，再用饱和碳酸氢钠中和过量的多聚磷酸，过滤、水洗、干燥得目标化合物；步骤2.合成3-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-羟基-5-甲基苯甲醛①.在圆底烧瓶中加入乌洛托品、2-(苯并[d]噻唑-2-基)-6-甲基苯酚和乙酸或三氟乙酸，加热回流24-36小时；②.反应完成后，加水稀释，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤旋干溶剂得粗品，通过硅胶柱分离提纯得黄色固体目标化合物；步骤3.合成(E)-4-(3-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-羟基-5-甲基苯乙烯基)-1-甲基吡啶-1-鎓碘化物Ⅰ.在圆底烧瓶中...
【专利技术属性】
技术研发人员：尹鹏，尹国兴，喻婷，李海涛，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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