本发明专利技术公开了一种苯并噻唑类的溶酶体靶向型pH荧光探针及其制备和应用，探针制备方法：在封管中将喹啉‑4‑甲醛，2‑甲基‑苯并噻唑和三甲基氯硅烷(TMSCl，催化剂)按摩尔比1:1:10溶于二甲基甲酰胺，加热100℃反应16小时，将沉淀过滤。用二氯甲烷溶解沉淀，经NaCO3溶液调节pH为8.0，经二氯甲烷萃取，干燥，重结晶得到纯品。该探针具有较大的Stokes位移(110nm)，对H+变化呈现较高的灵敏性和选择性。pKa值为3.52，pH线性范围3.0‑3.8。激光共聚焦实验表明，该探针能够靶向定位于溶酶体，并对弱酸性环境溶酶体pH变化做出响应。此外，该探针能够高灵敏检测极度酸性环境(pH<4)中大肠杆菌内pH变化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及荧光探针，具体涉及一种苯并噻唑类的溶酶体靶向型pH荧光探针及其制备方法应用。
技术介绍
细胞内H+作为一个重要的新陈代谢及细胞内参数，在调控许多生理和病理过程中发挥着关键性的作用，例如细胞的生长与凋亡、细胞周期调控、受体介导的信号转导、酶活性以及钙调控等。细胞内pH值并不是均匀分布的，细胞质呈弱碱性，pH值约为7.2；而一些细胞器，如溶酶体，内涵体和自噬体的pH呈弱酸性，位于4.0-6.0之间。其中溶酶体为单层膜包被的囊状结构，大小约0.025-0.8μm；内含50余种酸性水解酶，其弱酸性环境(pH4.5-5.5)有利于活化水解酶的功能，促进蛋白质在细胞代谢中的降解。pH异常往伴随着细胞功能紊乱，如溶酶体内水解酶变异，功能丧失进而诱发各类溶酶体贮积症等；特别是在细胞凋亡过程中，早期溶酶体内的pH梯度会消失。因此监测细胞内溶酶体的pH值变化有利于从分子水平上理解细胞的生理和病理过程。许多方法可用于检测细胞内pH值，主要包括核磁共振法、弱酸平衡法和荧光光谱法等。其中，基于荧光探针与氢离子作用引起荧光信号变化、荧光成像的荧光光谱法，则显示出其独特的时间和空间分辨率高的性质，且具有灵敏度高、操作简便、非破坏性等优点，成为分子水平上实时检测细胞内pH的重要手段。迄今为止，文献报道了许多性能优良的pH荧光探针，但只有很少部分探针具有溶酶体靶向定位功能，且这些探针大都Stokes位移较小，合成复杂。此外，极少有探针能够同时检测极端环境(如pH<4或pH>9)pH的变化。因此，非常有必要开发酸性pH探针，兼具大的Stokes位移，简易的合成方法，并能够靶向应用于弱酸性溶酶体以及极度酸性环境(pH<4)中大肠杆菌内pH变化的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种苯并噻唑类的溶酶体靶向型pH荧光探针及其制备方法；目的之二是提供该探针的用途，即在检测细胞内弱酸性溶酶体pH变化中的应用，以及在检测极度酸性环境(pH<4)中大肠杆菌内pH变化的应用。本专利技术提供的一种苯并噻唑类的溶酶体靶向型pH荧光探针，是2-(喹啉-4-乙烯基)苯并噻唑，其结构式为：本专利技术提供的一种苯并噻唑类的溶酶体靶向型pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：a.在封管中，将喹啉-4-甲醛，2-甲基苯并噻唑和三甲基氯硅烷(TMSCl)按摩尔比1:1:10溶于二甲基甲酰胺，其中TMSCl为催化剂，搅拌加热100℃反应16小时，冷却后过滤沉淀。b.用二氯甲烷溶解沉淀，经NaCO3溶液调节pH为8.0，并搅拌30min，然后用含有饱和氯化钠的二氯甲烷萃取3次，合并有机相，并用无水MgSO4干燥，减压蒸馏有机溶液，最后用二氯甲烷重结晶制得纯品。其合成路线如下：本专利技术的探针具有良好的细胞膜通透性，可用于弱酸性溶酶体以及极度酸性环境(pH<4)中大肠杆菌基质内pH变化的检测。与现有技术相比，本专利技术合成的苯并噻唑类的溶酶体靶向型pH荧光探针具有如下优点：(1)本探针是基于分子内电荷转移原理(ICT)设计的，喹啉基团为电子受体，苯并噻唑为电子给体，分子体系存在较强的ICT效应；在酸性条件下，苯并噻唑基团发生质子化，降低其给电子能力，导致ICT效应减弱，最终使得荧光发射减弱。(2)该探针具有较大的Stokes位移(110nm)，能有效降低造影过程中激发光的干扰。(3)对H+具有较高的灵敏性和选择性，不受其他常见金属离子的干扰。(4)pKa值为3.52，不仅能够对弱酸性pH环境进行响应，而且能够指示极度酸性(pH<4)环境pH的变化。(5)该探针具有良好的细胞膜通透性，不仅能够特异选择性检测溶酶体pH变化，同时能够检测极度酸性环境中大肠杆菌内pH的变化。(6)该探针合成方法简便，产率高，易于商品化生产。附图说明图1.本专利技术实施例1中探针QVBT随pH变化的紫外吸收光谱图。图2.本专利技术实施例1中探针QVBT在自然光下识别H+前后颜色变化，由淡黄色变为无色。图3.本专利技术实施例1中探针QVBT随pH变化的荧光发射光谱图。图4.本专利技术实施例1中探针QVBT在自然光下识别H+前后颜色变化，由蓝色变为无色。图5.本专利技术实施例1中探针QVBT的荧光强度I428随pH值变化的sigmoidal拟合曲线；插图：pH响应线性范围3.0-3.8。图6.本专利技术实施例1中探针QVBT分别在pH7.0和pH3.0时，在常见金属离子存在下对H+的选择性。图7.本专利技术实施例1中探针QVBT在人宫颈癌细胞(SiHa)中与市售溶酶体特异选择性染料LysoTrackerGreenDND-26的共定位成像图(pH7.4)。图8.本专利技术实施例1中探针QVBT分别在pH7.0和pH3.0时，与SiHa细胞共同孵育20min的激光共聚焦成像图。图9.本专利技术实施例1中探针QVBT分别在pH7.4，4.5，3.5和2.0时，与与大肠杆菌(E.coli)共同孵育2h的激光共聚焦成像图。具体实施方式实施例12-(喹啉-4-乙烯基)苯并噻唑(QVBT)的合成，步骤如下：在封管中，将喹啉-4-甲醛(0.471g,3mmol)，2-甲基苯并噻唑(382μL,3mmol)和三甲基氯硅烷(TMSCl,3.8μL,30mmol)按摩尔比1:1:10溶于二甲基甲酰胺，其中TMSCl为催化剂，搅拌加热100℃反应16小时，冷却后过滤沉淀。用二氯甲烷溶解沉淀，经NaCO3溶液调节pH为8.0，并搅拌30min，然后用含有饱和氯化钠的二氯甲烷萃取3次，合并有机相，并用无水MgSO4干燥，减压蒸馏有机溶液，最后用二氯甲烷重结晶得到棕色固体0.78g，产率为90％。1HNMR(DMSO-d6,300MHz),δ(ppm)7.39(m,3H),7.48(d,3H),7.66(d,2H),7.73(t,1H),7.88-7.97(d,1H),8.04-8.17(d,1H),9.01(d,1H).13CNMR(DMSO-d6,300MHz),δ(ppm)119.95,112.48,123.27,124.14,125.09,126.04,126.37,126.96,128.15,128.38,130.50,134.23,135.09,139.69,148.48,150.94,163.32,169.09.ESI-HRMS:m/zfound289.0792for[M+H]+,calcd289.0794for[M+H]+.Elementalanalysis:foundC,75.62；H,4.08；N,8.87；S,11.34,calcdC,74.97；H,4.19；N,9.17；S,11.12.实施例2将实施例1中的探针QVBT用无水乙醇配制浓度为1mM的储备液保存。实验中用乙醇/水(V/V，1/2)体系将探针稀释为终浓度10μM，用HCl(0.3M,0.6Mand1.0M)和NaOH(0.4M)调节该体系的pH值，记录QVBT随pH变化的紫外吸收光谱(图1)。随着pH值的降低，291nm处的吸收峰依次下降，317nm处的吸收峰逐渐增强，并且在295nm附近出现一个明显的等吸收点。同时溶液颜色由淡黄色变为无色(图2)。实施例3同样用乙醇/水(V/V，1/2)体系将探针QVBT稀释为终浓度1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种苯并噻唑类的溶酶体靶向型pH荧光探针，其特征在于，它是2‑(喹啉‑4‑乙烯基)苯并噻唑(QVBT)，其结构式为：
【技术特征摘要】
1.一种苯并噻唑类的溶酶体靶向型pH荧光探针，其特征在于，它是2-(喹啉-4-乙烯基)苯并噻唑(QVBT)，其结构式为：2.如权利要求1所述的一种苯并噻唑类的溶酶体靶向型pH荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下方法：a.在封管中，将喹啉-4-甲醛，2-甲基苯并噻唑和三甲基氯硅烷(TMSCl)按摩尔比1:1:10溶于二甲基甲酰胺，搅拌加热100℃反应16小时，冷却后过滤沉淀。b.用二氯甲烷溶解沉淀，...
【专利技术属性】
技术研发人员：樊丽，葛金印，林博，南明，董川，双少敏，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14
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