一种基于香豆素的双光子溶酶体极性探针、其制备方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种基于香豆素的双光子溶酶体极性探针、其制备方法及其用途，其中基于香豆素的双光子溶酶体极性探针的结构式如下：本发明专利技术荧光探针分子在不同溶剂体系中，由于溶剂极性的不同表现出规律的荧光变化且不受其他环境因素(如pH等)影响。细胞毒性测试表明本发明专利技术对细胞几乎没有毒性作用，双光子荧光显微成像实验表明本发明专利技术对Hela细胞及CHO细胞等渗透性都较好，适于细胞内定位于溶酶体及检测溶酶体极性的变化情况。

【技术实现步骤摘要】
一、
本专利技术涉及一种荧光探针，具体地说是一种基于香豆素的双光子溶酶体极性探针、其制备方法及其用途。二、背景领域极性是化学化工生产中的一种重要参数，一些特定的无机有机反应均依赖于极性的参与。在生物系统里，尤其在细胞层面上，极性决定了大多数蛋白质和酶的联系并反映了细胞及细胞器膜组分的通透性，甚至极性的反常变化与一些疾病的产生关系密切。溶酶体是真核细胞中的一种细胞器，内含多种水解酶，专司分解各种外源和内源的大分子物质。现已知各类细胞的溶酶体中约含60种酶，包括蛋白质、糖类、脂类等物质的水解酶类，如酸性磷酸脂酶、组织蛋白酶、核糖核酸酶以及芳香基硫酸脂酶A和B等。然而，目前为止针对溶酶体极性进行定性的研究还是少之又少，因此检测溶酶体内极性的变化是十分重要的。荧光探针是在一定体系内，当一种物质或体系中某一物质性质发生变化时，荧光信号能发生相应改变的分子。荧光光谱由于其检测方便，灵敏等优点在痕量检测中展现了优越的性能。近些年来，双光子荧光光谱凭借着自身稳定性高，光漂白性好，细胞穿透性高等优点被广泛使用。因此，能够使用双光子荧光探针来检测细胞溶酶体内极性的变化是非常理想的选择。香豆素作为一个传统的“溶剂致变色”基团，具有良好的光谱特性和水溶性，对包裹在其周围溶剂分子的极性变化很敏感，并且对细胞几乎没有毒性。因此，香豆素非常适合作一个极性探针的荧光报告基团。目前检测细胞内极性的探针大多为单光子激发，然而单光子荧光探针不仅易使生物本体产生自发荧光干扰，而且短的激发波长还会对细胞产生光致毒。因此，在香豆素基团上连接一个较大的共轭结构使其能够被双光子激发具有突破性的意义。三、
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种基于香豆素的双光子溶酶体极性探针、其制备方法及其用途，所要解决的技术问题是通过分子设计遴选合适的荧光探针结构，以实现双光子成像定性检测细胞中溶酶体的极性变化。本专利技术极性探针具有选择性专一、灵敏度高等优点，细胞毒性测试表明本专利技术极性探针对细胞几乎没有毒性作用。本专利技术极性探针(Lyso-OC)，是以香豆素为母体，其结构由下式表示：本专利技术极性探针的制备方法，包括如下步骤：将7-((4-甲氧基苯基)乙炔)-3-羧酸-香豆素(1g，3mmol)、N,N-二异丙基乙胺(1.2g，9mmol)、1-羟基苯并三唑(0.65g，4.5mmol)、EDC·HCl(0.65g，3.3mmol)以及2-吗啡-1-乙胺(1.2g，9mmol)加入史莱克瓶中，在无水无氧条件下加入30mLN,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌反应24h；反应结束后向反应液中加入50mL二氯甲烷将反应物溶解，再用30mL水萃取(3次)，收集有机相，将有机相通过柱层析200-300目硅胶，洗脱液乙酸乙酯：石油醚＝2:1(v/v)，得到目标产物Lyso-OC0.3g，产率30％。本专利技术极性探针Lyso-OC的合成过程如下：本专利技术极性探针在定性检测环境和细胞中溶酶体极性变化时作为检测试剂应用。将本专利技术极性探针分子溶于DMSO中制得1mM的母液，取50μL的该母液于10mL容量瓶中，再用不同极性(极性参数设置为Δf)的溶剂定容，配制成5μM溶液。极性探针单光子和双光子的激发波长分别为375nm和750nm，检测390-650nm范围内的荧光光谱变化，可以明显观察到从1,4-二氧六环(极性很小，Δf≈0.09)溶剂极性依次增大到水(极性很大，Δf≈0.32)时，荧光的最大发射峰从470nm红移至525nm(斯托克斯位移约为55nm)，荧光强度也随之降低了约550倍。为了排除溶剂效应的干扰并且进一步研究本专利技术极性探针与溶剂极性的关系，通过调节水-四氢呋喃中水的含量来控制混合溶剂的极性，取50μL的该母液于10mL容量瓶中，再用不同水含量的水-四氢呋喃混合溶剂定容，配置成5μM溶液。单光子和双光子的激发波长和检测范围均同上，可以观察到水含量从1％(Δf≈0.22)增加到80％(Δf≈0.31)时，荧光的最大发射峰从475nm红移至525nm(斯托克斯位移约为50nm)，荧光强度随之降低了约75倍，荧光量子产率也随之从55％逐渐降低到了约1％，同时荧光寿命也随着极性的增加线性减少。随后，继续研究本专利技术极性探针在其他不同溶剂的混合体系中(如水-1,4-二氧六环、水-甲醇等)随着极性变化而产生的荧光变化，发现其均呈规律性变化。因此本专利技术极性探针分子非常有潜力运用于生物检测。为了排除环境pH值对本专利技术极性探针分子荧光变化情况的影响，取50μL的该母液于10mL容量瓶中，再用不同pH的水定容。单光子和双光子的激发波长和检测范围均同上，可以观察到当环境的pH值从4.0变化到8.0(生物系统中常见的pH范围)时，荧光探针的荧光强度基本没有变化，证明pH值的变化对探针的作用影响非常小，并且能够很好地在生物应用中反映极性的变化。本专利技术极性探针检测微环境极性变化的机理是在极性探针(Lyso-OC)分子吸收光子的过程中，由于整个探针分子各个部分偶极矩的不同而导致“溶剂致变色”现象。当溶剂分子包裹在探针分子周围，“溶剂致变色”现象会导致分子在基态和激发态稳定化能的不同。因此，当溶剂极性增加时，探针分子的激发态需要释放更多地能量来内部转换到一个比之前更稳定的激发态(即比之前激发态更低的能级)，甚至可能在一些快速的内部转换之后进一步转换为另一种机理不同却更稳定的激发态(具体为ICT激发态转换为TICT激发态)，这也具体表现为荧光强度减弱或荧光光谱红移。本专利技术荧光探针分子结构简单，易于合成，以荧光强弱和颜色的变化来检测微环境极性的变化，操作简单，快速灵敏，并且对细胞毒性很小，能够用于检测溶酶体内的极性变化。四、附图说明图1是5μM探针在不同极性的溶剂中的荧光光谱。图2是5μM探针在不同极性的溶剂中的紫外吸收光谱。图3是5μM探针在不同水含量的水-四氢呋喃混合体系中的荧光光谱。图4是5μM探针在不同水含量的水-四氢呋喃混合体系中的紫外吸收光谱。图5是5μM探针在不同水含量的水-四氢呋喃混合体系中量子产率随水含量变化线性关系。图6是5μM探针在不同水含量的水-四氢呋喃混合体系中的荧光寿命及其随水含量变化线性关系。图7是5μM探针在不同pH水中的荧光变化情况。图8是5μM探针在四氢呋喃中的双光子有效吸收截面积。图9是在不同含量(10μM、20μM、30μM)的探针分子的作用下的细胞存活率。图10是探针分子在HeLa细胞中的溶酶体定位成像。图11是用10μM探针分子培养HeLa细胞0.5小时本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于香豆素的双光子溶酶体极性探针，其特征在于其结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种基于香豆素的双光子溶酶体极性探针，其特征在于其结构式为：
2.一种权利要求1所述的基于香豆素的双光子溶酶体极性探针的制备方法，其特征在于
包括如下步骤：
将3mmolOC7、9mmolN,N-二异丙基乙胺、4.5mmol1-羟基苯并三唑、3.3mmolEDC·HCl
以及9mmol2-吗啡-1-乙胺加入史莱克瓶中，在无水无氧条件下加入30mLN,N-二甲基甲酰胺，
室温搅拌反应，反应结束后向反应液中加入二氯甲烷将反应物...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟祥明，江嘉诚，朱满洲，邵宗龙，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34