一种双光子荧光探针及在检测缺氧区硝基还原酶中的应用制造技术

本发明专利技术公开了新的双分子荧光探针，其化学名称为6‑((4‑硝基苄基)氧基)‑2,3,4,4a‑四氢‑呫吨‑1‑酮，本发明专利技术还公开了所述双光子荧光探针在检测细胞中硝基还原酶的应用。本发明专利技术的探针随硝基还原酶含量的增加荧光强度显著增强，使用本发明专利技术公开的探针可通过荧光成像技术检测肿瘤缺氧区域的硝基还原酶含量，从而评价和研究肿瘤缺氧区域的缺氧水平。

【技术实现步骤摘要】
一种双光子荧光探针及在检测缺氧区硝基还原酶中的应用
本专利技术涉及一种荧光探针，同时涉及其在检测缺氧区域硝基还原酶(NTR)中的应用，属于有机小分子荧光探针领域。
技术介绍
恶性肿瘤在生长过程中，会存在一种无限制疯狂生长的状态，致使血管中的血液提供的氧气不足以支持细胞的生长，进而形成高度缺氧区域，即为肿瘤乏氧区域。缺氧是实体肿瘤微环境的一个很重要的特征。一般情况下，大部分实体肿瘤内氧含量在5%左右，有的肿瘤区域中氧含量甚至能够下降到1%左右。缺氧区域的形成使得肿瘤微血管异常，导致癌症化疗药物难以进入该区域，进而降低了抗癌药物的疗效。基于此，评估肿瘤内缺氧区域的缺氧程度在预测癌症治疗的效果和相关研究中非常重要。目前已报到的检测肿瘤区域缺氧程度的方法有：氧压力测量、血流速度、缺氧标记法等，但是这些检测操作很繁琐，应用不便。由于缺氧生物标记法具有较高的选择性和灵敏度，使其成为一种极为重要的乏氧检测方法。一般而言，缺氧环境中随着氧含量下降会导致生物体内一些还原性酶的含量和活性增加，例如：硝基还原酶、偶氮还原酶和心肌黄酶等。研究也证实，在实体肿瘤内，硝基还原酶的含量增加与缺氧程度密切相关，因此，借助检测硝基还原酶的含量可以用于评价肿瘤区域的缺氧程度。近几年，科研工作者开发了许多硝基还原酶的荧光探针，但所述大部分探针是激发光波长处于见光区的单分子荧光探针，应用时多有背景干扰、散射干扰等缺陷，灵敏度不高。而双光子荧光探针具有近红外激发、背景干扰小、散射干扰小、灵敏度和选择性更高，避免光漂白和光致毒现象产生，以及对生物体伤害小等优点，在生物活体分析检测中显示出很大的优越性，引起科研工作者的广泛关注。但检索发现有关检测缺氧区域硝基还原酶的双光子荧光探针还很稀缺，未见广泛报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种双光子荧光探针，可以用于检测缺氧区域硝基还原酶。利用本专利技术的探针通过荧光成像技术检测肿瘤缺氧区域的硝基还原酶含量可于评价和研究肿瘤缺氧区域的缺氧水平。一种双光子荧光探针，其化学式如下所示：。该荧光探针命名为6-((4-硝基苄基)氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮，简称GCTPOC-HY。上述双光子荧光探针(GCTPOC-HY)的制备方法如下：1）化合物6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮的合成：在100mL圆底烧瓶中，加入2,4-二羟基苯甲醛10mmol，环己烯酮15mmol和三乙烯二胺25mmol，再加入体积比为1:1的水和1,4-二氧六环混合溶剂60mL，氮气氛围下，加热回流两天，减压下蒸除溶剂，残渣通过硅胶柱，用石油醚：乙酸乙酯=2：1的洗脱剂洗脱分离，真空干燥得淡黄色固体6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮；简称GCTPOC；。2）化合物6-((4-硝基苄基)氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮的合成：将化合物6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮0.3mmol与4-硝基苄溴0.6mmol，碳酸钾0.6mmol溶解在N,N-二甲基甲酰胺3mL中，室温过夜搅拌，减压下蒸除溶剂，残渣通过硅胶柱，用石油醚：乙酸乙酯=2：1的洗脱剂洗脱分离，真空干燥，得到化合物6-((4-硝基苄基)氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮。简称：GCTPOC-HY；。本专利技术制备的荧光探针GCTPOC-HY可以应用于检测缺氧区域硝基还原酶，其在缺氧状态下能专一识别硝基还原酶，并以荧光增强方式实现对硝基还原酶的识别。本专利技术所述检测缺氧区域硝基还原酶的双光子荧光探针GCTPOC-HY本身由于硝基的强吸电子能力导致d-PET效应而淬灭分子的荧光，当在硝基还原酶作用下，化合物6-((4-硝基苄基)氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮GCTPOC-HY的硝基还原成氨基，并发生1,6-质子转移后，释放出化合物6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮(GCTPOC)，荧光强度得到大幅度提升。识别机理如下：本专利技术提供的检测缺氧区域硝基还原酶的双光子荧光探针属双光子类荧光探针，其与功能相近的硝基还原酶荧光探针比具有显著优势，且所述探针在水相中的选择性和合成手段也具有新颖性和简便性。实验证实，本专利技术提供的检测缺氧区域硝基还原酶的双光子荧光探针制备的溶液，当向其加入硝基还原酶后荧光显著增强，该结果及现象为生物学成像应用奠定了理论基础，预示其在激光激发荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。相应的，利用本专利技术的探针通过荧光成像技术检测肿瘤缺氧区域的硝基还原酶含量可于评价和研究肿瘤缺氧区域的缺氧水平。附图说明图1：探针在磷酸缓冲液中的吸收光谱图，探针的浓度：5µM；图2：探针在水相中的选择性，其中激发波长为450nm；探针的浓度：5µM，选择性例子的浓度为2.5mM；图3：探针与硝基还原酶作用的滴定实验，其中激发波长为450nm；探针的浓度：5µM；图4：探针与硝基还原酶作用的动力学实验。其中激发波长为450nm；探针的浓度：5µM。硝基还原酶浓度分别为0、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2.5µg/mL，测试时间：1h，测试间隔：5min；图5：探针的单光子细胞成像应用，激发波长：488nm,发射波段：500-550nm；图6：探针的双光子细胞成像应用，激发波长：760nm,发射波段：500-550nm；图7：探针的核磁1HNMR图谱；图8：探针的核磁13CNMR图谱；图9：探针的高分辨质谱图谱。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明.实施例1双光子荧光探针的合成工艺为：1）化合物6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮(3)的合成：在100mL圆底烧瓶中，加入2,4-二羟基苯甲醛(1)10mmol，环己烯酮(2)15mmol和三乙烯二胺25mmol，再加入水/1,4-二氧六环混合溶剂60mL（V/V=1:1），氮气氛围下，加热回流两天，减压下蒸除溶剂，残渣通过柱层析分离，得淡黄色固体6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮(3)，简称GCTPOC。产率：15%。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):10.17(s,1H),7.34(d,J=2.0Hz,1H),7.34(d,J=8.4Hz,1H),6.41(dd,J1=8.0Hz,J2=2.0Hz,1H),6.29(d,J=2.4Hz,1H),4.94(m,1H),2.36(m,3H),1.91(m,2H),1.67(m,1H);HR-MScalculatedforC13H12O3[M-H]-m/z215.0703,found215.0747。化合物6-((4-硝基苄基)氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮(5)的合成：将化合物6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮(3)0.3mmol与4-硝基苄溴(4)0.6mmol，碳酸钾0.6mmol溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)3mL中，室温过夜搅拌，减压下蒸除溶剂，残渣通过柱层析分离，得到化合物6-((4-硝基苄基)氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮(5)。产率：35%。其结果简单如图7-图9所示，图7为双光子乏氧荧光探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双光子荧光探针，其特征在于，化学式如下所示：。

【技术特征摘要】
1.一种双光子荧光探针，其特征在于，化学式如下所示：。2.根据权利要求1所述的双光子荧光探针，其特征在于，采用如下制备方法制备而成：1）化合物6-(4-羟基氧基)-2,3,4,4a-四氢-呫吨-1-酮的合成：在100mL圆底烧瓶中，加入2,4-二羟基苯甲醛10mmol，环己烯酮15mmol和三乙烯二胺25mmol，再加入体积比为1:1的水和1,4-二氧六环混合溶剂60mL，氮气氛围下，加热回流两天，减压下蒸除溶剂，残渣通过硅胶柱，用石油醚：乙酸乙酯=2：1的洗脱剂洗脱分离，真空干燥得淡黄...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，刘展榕，徐安，唐永和，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37