本发明专利技术公开了一种识别线粒体pH的双光子荧光探针，本发明专利技术还公开了所述荧光探针在检测线粒体pH中的应用。实验证明：本发明专利技术的双光子荧光探针基于双通道检测pH，并很好地定位于线粒体中。本发明专利技术所述荧光探针的特性对于检测生物体内线粒体中的pH水平具有突出优点，并能很好的穿透组织，在荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种识别线粒体pH的新型双光子荧光探针及其应用，尤其涉及一种专一识别线粒体的菲醌类化合物荧光探针及其应用；属于有机小分子荧光探针领域。
技术介绍
作为人体中重要的细胞器之一，线粒体因含有核糖体且自身带有遗传物质而具有特殊性，它是有氧呼吸产生能量的主要场所，被誉为“细胞能量工厂”。正常情况下人体内线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。细胞凋亡时发生的一系列形态和生化变化，是受凋亡信号系统激活所导致的细胞内一系列酶的活性以及凋亡相关基因表达的变化调控的。研究表明，细胞内pH、线粒体膜电位(ΔΨm)等生物物理性状的改变与细胞凋亡信号系统的调控有密切的关系。线粒体在凋亡研究领域中日益受到重视，而线粒体内pH因维持和调控线粒体功能的重要性亦成为研究的热点之一。人体线粒体出现异常会导致线粒体疾病，线粒体疾病为一大类遗传代谢疾病，线粒体病主要包括：母系遗传Leigh综合征，线粒体肌病，多系统疾病、心肌病等等。线粒体病的遗传方式比较复杂，导致疾病的原因往往主要由核基因和线粒体基因造成，且其临床表现复杂，确切病因的诊断十分困难，往往通过大分子酶学活性检测分析并结合遗传学基因分析的双重手段确定病因。所以，对其异常水平的检测应引起人们的高度重视。基于此，开发新型的荧光探针，通过检测线粒体内pH的变化来判断线粒体水平的异常成为亟待解决的技术问题。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种识别线粒体pH的菲醌类化合物双光子荧光探针及其应用。本专利技术所述的新型适于识别线粒体pH的双光子荧光探针PID，其特征在于：其化学结构式如式（I）所示：（I）上述化合物的制备方法是：将2，3，3-三甲基-3H-吲哚1与碘乙烷在乙腈做溶剂条件下加热回流生成化合物2，然后将化合物2与对苯二甲醛发生反应得到产物3，产物3与菲醌在冰醋酸条件下反应得最终产物PID，其NMR图谱见图1-2。上述化合物的制备反应式如下：上述适于专一识别线粒体pH的荧光探针在检测线粒体中pH变化的应用。上述的应用中：所述荧光探针是以双通道方式实现识别线粒体pH。上述荧光探针能高选择性识别线粒体pH，该探针在弱酸性条件下（pH范围在4-6）用405nm波长激发时其发射波长在425-475nm,从而发出蓝光，而在弱碱性条件下（pH范围在7-8）同样用405nm波长激发时其发射波长发生变化红移至500-550nm而发绿光。通过在不同的pH中发出不同的光以双通道形式来实现检测不同的pH。在细胞中，线粒体为弱碱性环境，通过与线粒体中弱碱性pH作用发绿光，实现该探针对pH的响应进而能较间接的识别线粒体的作用。实验证实：当检测环境是水相时，由本专利技术所述的线粒体pH荧光探针的溶剂化效应显示，在水中探针的荧光强度相对较弱（图3），其荧光量子产率为0.02（参见表1：化合物的光物理性质），这使得探针能更好的用于人体环境的检测，大大降低了探针对人体的危害性，同时也消除了自身的干扰性。在pH滴定实验中（图4），探针对pH的响应出现双峰。随着溶液pH的增大，探针出现一定的规律性。在pH范围4-6时，其546nm处的荧光峰大于456nm处的峰值，溶液显示546nm的发光，继而溶液发蓝光。当pH范围7-8时,456nm处的峰值高于546nm的强度，而发出绿光，通过探针在不同pH中发不同的光，而能很好地对pH响应并进行双通道的检测。另外细胞实验（图5）证实，用405波长激发，吸收波长控制在425-475nm时，通道1发蓝光，当吸收波长控制在500-550nm时，通道2发绿光，可以证实该探针在细胞中和体外测试一样，能实现双通道检测。通过与商用线粒体探针MTR进行拟合，该探针能明显地定位于线粒体中，从而实现了线粒体内的双通道检测pH。该探针同时利用双通道完成了组织内成像，其深度高达120μm（图6），可见该探针可以深透组织，实现深度检测。基于上述实验结果，可以证明本专利技术所述的识别线粒体pH的菲醌类化合物荧光探针是一类新型的高选择性识别线粒体pH的荧光探针分子，该探针合成路径简便，易于应用。通过体外滴定pH，细胞成像实验可以判断该探针能够实现其双通道检测线粒体pH的作用，并且在组织中有一定的穿透能力。本专利技术提供的识别线粒体pH的菲醌类化合物荧光探针有其显著优势，且本专利技术所述菲醌吲哚类化合物在水相中的pH选择性和合成手段也具有新颖性和简便性。基于本专利技术提供的识别线粒体pH的菲醌类化合物荧光探针能实现双通道检测，并且实现组织内pH成像，为生物学成像应用奠定了理论基础，预示其在荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。附图说明图1：PID1HNMR(400MHz,MeOD)图2：PID13CNMR(100MHz,DMSO-d6)图3：探针的溶剂化效应。激发波长405nm。图4:pH滴定实验；其中激发波长为405nm；探针母液的浓度：10-3M，稀释5ml进行测试。图5:探针的细胞生物成像应用。图6：探针的组织成像应用。具体实施方式实施例1化合物2的合成：将1.0g(6.25mmol)的2，3，3-三甲基-3H-吲哚1，溶于20mL乙腈中，将碘乙烷5.3mL(31.25mmol)滴加至混合液中，加热回流15h，反应体系由淡黄色变为红褐色。反应结束后冷却至室温，将溶剂蒸干，所得固体用乙醚洗涤过滤得到红色固体。产率：86%。化合物3的合成：将0.30g(2mmol)对苯二甲醛，0.75g化合物2溶于20mL无水乙醇中。在氮气保护下加热回流过夜，反应体系由黄色变为红色。反应结束后，EA萃取，用PE：EA（10:1）淋洗液过柱提纯得红色固体。产率：80%。化合物PID的合成：将0.21g(1mmol)菲醌，0.47g（1.1mmol）化合物3，1.54g醋酸铵和10mL冰醋酸混合在50mL的圆底烧瓶中，在氮气保护下加热回流8h，反应结束后冷却至室温，将液体倒入100mL的冰水中，将沉淀过滤，水洗三次烘干，乙醇重结晶得到红色固体。产率：70%。其中，图1：PID1HNMR(400MHz,MeOD)；图2：PID13CNMR(100MHz,DMSO-d6)。1HNMR(400MHz,MeOD):δ8.85(s,1H),8.72(s,1H),8.59(s,1H),8.55(s,1H),8.51-8.48(d,J=12.0Hz,2H),8.34–8.32(d,J=8.0Hz,2H),7.93–7.90(m,1H),7.86–7.79(m,2H),7.78–7.67(m,1H),4.84–4.78(q,J=8.0Hz,2H),1.93(s,6H),1.68–1.65(t,J=7.5Hz,3H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6):181.73,153.37,148.32,144.58,140.90,138.08,135.29,134.65,131.90,130.04,129.66,128.60,128.27,127.74,127.25,126.86,126.41,126.07,124.70,124.35,123.66,122.84,122.69,122.47,115.74,113.17,63.44,52.86,42.88,30.24,29.09,23本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种识别线粒体pH的双光子荧光探针，其特征在于，，其化学结构式如式（I）所示：（） 。
【技术特征摘要】
1.一种识别线粒体pH的双光子荧光探针，其特征在于，，其化学结构式如式（I）所示：（）。2.根据权利要求1所述的双光子荧光探针，其特征在于，由以下制备方法制备而成：将2，3，3-三甲基-3...
【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，刘勇，孟芳芳，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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