本发明专利技术涉及一种双光子RNA荧光探针及其在活细胞成像中的应用，结构通式如(I)所示，其中：R为烷基、羟烷基或醚基；X为溴或碘。本发明专利技术双光子RNA荧光探针是一类新型的RNA选择性识别的双光子荧光探针，可在标记或显示RNA在活细胞中分布中应用，该探针具有膜通透性好、细胞毒性小、显色强的特点，可开发为RNA相关的生理、病理学研究用生物检测试剂。
A two-photon RNA fluorescent probe and its application in live cell imaging
The invention relates to a two-photon RNA fluorescent probe and its application in living cell imaging, wherein the general structure is shown as (I), wherein R is an alkyl group, a alkyl group or an ether base, and a X is bromine or iodine. The invention of two-photon fluorescence probe RNA is two-photon fluorescence probe for a class of RNA selective recognition model, in marking or display applications RNA distribution in living cells, the probe has the characteristics of membrane permeability, cell toxicity, strong color, can be developed into research for biological detection reagent, physiological RNA the pathology.
【技术实现步骤摘要】
一种双光子RNA荧光探针及其在活细胞成像中的应用
本专利技术涉及一种荧光探针，特别涉及一种用于活细胞中RNA成像的双光子荧光探针。
技术介绍
在细胞内的各种生命物质中，核糖核酸(RNA)是重要的生物大分子，其在催化生物反应、基因表达调控等生物学过程中扮演着极其重要的角色。RNA主要存在于细胞核的核仁区和细胞质中，其定位、活动、多寡、形态等包含着重要的生命科学信息，这些信息与医学诊断和治疗息息相关。因此，核仁和细胞质中的RNA成像对生物化学、生物医药、生命科学等具有十分重要的意义。目前的荧光成像技术，尤其是双光子荧光成像技术，在实时监测活细胞中生物分子的形态、多寡等方面得到了广泛应用。双光子荧光成像技术具有高检测灵敏度、大的穿透深度、图像高保真、低的光毒性和光漂白性等优势，获得了生物、生命、医学等学科研究者们的青睐。为适应当前形势，各种能够成像活细胞内不同靶标的双光子荧光探针已成为研究热点。与众多的商业化探针(如DNA探针)相比，RNA探针非常少。目前只有分子探针公司(MolecularProbesCo.)提供一个可用RNA成像的探针“SYTORNA-Select”，但该探针的化学结构式仍未对外公布。专利CN103265947A、CN103275699A分别提供了一种用于活细胞成像的RNA荧光探针，但该探针未能实现双光子荧光成像。因此，在活细胞RNA荧光成像检测方面，依然缺乏优良的双光子荧光探针，这一现状亟待解决。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述不足，而提供一种双光子RNA荧光探针，该探针具有膜通透性好、细胞毒性小、显色强的特点。本专利技术的另一目的是提供该双光子RNA荧光探针在标记或显示RNA在活细胞中分布的应用。本专利技术采取的技术方案为：一种双光子RNA荧光探针，结构通式如(I)所示：其中：R为烷基、羟烷基或醚基；X为溴或碘。上述双光子RNA荧光探针中：所述的R优选C1-12的烷基、C1-12的羟烷基或乙醚基；进一步优选甲基、乙基、丁基、十二烷基、羟乙基或乙醚基。所述的双光子RNA荧光探针最优选2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(简称为IE)。上述双光子RNA荧光探针的制备方法：先卤代反应在2-甲基苯并噻唑氮上引入R基，并获得苯并噻唑盐，然后利用苯并噻唑盐与3-甲酰基吲哚通过knoevenagel反应得到最终产物。所述的双光子RNA荧光探针(IE)的制备反应式如图1所示。上述双光子RNA荧光探针在标记或显示RNA在活细胞中分布的应用。所述的细胞为HeLa细胞。将本专利技术双光子RNA荧光探针应用在HeLa细胞的染色，标记后的双光子荧光图像显示，在细胞的细胞质和核仁区有明显的荧光分布，明确提示所述探针能够在活细胞中专一性成像细胞质和核仁中的RNA，并在经核糖核酸酶(RNase)消化实验后的细胞进行对比实验后得到进一步证实。在HeLa细胞上用MTT法对所述探针的细胞毒性进行了研究，测试HeLa细胞在所述探针孵育2、4、8、12、24小时后的细胞存活率，在染色12小时之内，HeLa细胞的存活率还在90％以上，这表明本专利技术所述双光子荧光探针细胞毒性小，具有较好的膜通透性，能成像活细胞中细胞质和核仁区的RNA。本专利技术双光子RNA荧光探针是一类新型的RNA选择性识别的双光子荧光探针，该探针具有膜通透性好、细胞毒性小、显色强的特点，可开发为RNA相关的生理、病理学研究用生物检测试剂。附图说明图1为2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐的制备反应式；图2为2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)的RNA双光子荧光滴定图；a为双光子荧光光谱；b为最大荧光强度随RNA与探针浓度比的变化图；图3为2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)对活性Hela细胞进行染色在800纳米激光辐照下得到的双光子荧光照片；a为双光子荧光照片；b为明场激光扫描的微分干涉显微照片；c为ab两图的合并图(共定位图)；图4为HeLa细胞经核糖核酸酶(RNase)处理前后，用2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)染色的细胞照片对比图；a)为核糖核酸酶(RNase)处理前，用2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)染色HeLa细胞照片；b)为核糖核酸酶(RNase)处理前，明场激光扫描的微分干涉显微照片；c)为核糖核酸酶(RNase)处理后，用2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)染色HeLa细胞照片；d)为核糖核酸酶(RNase)处理后，明场激光扫描的微分干涉显微照片；图5为2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)在HeLa细胞上的毒性(MTT)实验中细胞存活率随孵育时间的变化图；孵育时间：2、4、8、12、24小时，孵育浓度5μM。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明。实施例1：2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐(IE)的合成将2-甲基苯并噻唑(0.05mol，7.46g)与2-碘乙醇(0.05mol，7.81g)溶解在甲苯(50ml)中，搅拌4小时，随后回流反应30分钟，冷却至室温，过滤，乙醚洗涤，得到N-乙醇-2-甲基苯并噻唑碘盐。将N-乙醇-2-甲基苯并噻唑碘盐(0.01mol，0.32g)与3-甲酰基吲哚(0.01mol，0.145g)溶于甲醇(20ml)中，滴加几滴哌啶，回流反应4h，无水乙醇洗涤，得到褐色粉末，产率77％。1HNMR(400MHZ):12.478(s,1H),8.448(t,J＝7.66,2H),8.342(d,J＝7.96,1H),8.205(d,J＝4.96,1H),8.16(t,J＝9.72,1H),7.798(t,J＝7.76,1H),7.713(q,J＝9.29,1H),7.604(t,J＝5.4,2H),7.357(d,J＝4.36,2H),5.261(t,J＝5.68,1H),4.959(t,J＝4.34,2H),3.965(q,J＝4.88,2H).13CNMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):173.40,144.44,142.06,138.38,137.87,129.23,127.81,127.27,,125.17,124.37,124.31,122.89,121.31,116.72,114.68,113.62,107.11。实施例2：2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-甲基苯并噻唑碘盐的合成将(10mmol，1.49g)2-甲基苯并噻唑与(20mmol，2.84g)碘甲烷溶解在50ml甲苯中，搅拌4小时，随后回流反应30分钟，冷却至室温，过滤，乙醚洗涤，得到N-甲基-2-甲基苯并噻唑碘盐。将(1mmol，0.291g)N-甲基-2-甲基苯并噻唑碘盐与0.145g(1mmol)3-甲酰基吲哚溶于20ml甲醇中，滴加3滴哌啶，回流反应6h，无水乙醇洗涤，得到褐色粉末，产率70％。IMT-M:1HNMR(400MHZ):12.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双光子RNA荧光探针，结构通式如(I)所示：
【技术特征摘要】
1.一种双光子RNA荧光探针，结构通式如(I)所示：其中：R为烷基、羟烷基或醚基；X为溴或碘。2.根据权利要求1所述的一种双光子RNA荧光探针，其特征是，所述R选C1-12的烷基、C1-12的羟烷基或乙醚基。3.根据权利要求2所述的一种双光子RNA荧光探针，其特征是，所述R为甲基、乙基、丁基、十二烷基、羟乙基或乙醚基。4.根据权利要求3所述的一种双光子RNA荧光探针，其特征是，它为2-[2-(1H-吲哚-3-基)乙烯基]-3-(2-羟乙基)苯并噻唑碘盐。5.权利要求4所述的一种双光子RNA荧光探针的制备方法，其特征是，将2-甲基苯并噻唑与2-碘乙醇溶解在甲苯中，...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵宁，李龙龙，冯瑞卿，彭丹，李冰，
申请(专利权)人：山东省科学院新材料研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37
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