一种双光子甲醛荧光探针及其制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种双光子甲醛荧光探针及其制备与应用，是一种基于分子内电荷转移机制的以1,8‑萘酰亚胺为双光子荧光团的新型甲醛类探针。探针分子具有良好的光稳定性以及很大的斯托克位移，该探针在中性缓冲液中能够很好检测甲醛浓度，同时相对于其他醛类化合物，探针对甲醛具有很好的专一性。双光子共聚焦荧光显微镜成像实验很好地证明了探针能够渗透细胞膜进入细胞中且能够在细胞中检测甲醛浓度的变化，为研究细胞中甲醛的生理作用提供一种有效的研究工具。

【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种检测细胞内甲醛的双光子荧光染料，具体涉及基于1,8-萘酰亚胺的新型双光子甲醛类荧光探针的制备方法及应用。(二)
技术介绍
甲醛作为一种公认的致癌物质，主要来源有三：一类是来源于工业生产，一类来自于自然界的释放，一类是来源于内源性的甲醛,例如氧化酶、嗜中性粒细胞髓过氧化物酶等生物反应就能释放甲醛。在正常的人体血液中，甲醛浓度就可达到0.1mM左右。但是体内过量的甲醛能够引起呼吸道慢性疾病、胚胎畸形、阿兹海默病和癌症等等。在现阶段的甲醛检测方法当中，大多是检测空气中的甲醛，国内外报道的检测细胞内甲醛的探针还是寥寥无几。目前能够专一性检测细胞内甲醛的主要方法有两种，一种是氨基与甲醛反应后，随后自发发生2-氮杂-柯普重排以及水解，生成信号增强的效果；另一种利用肼和甲醛反应生成产物达到荧光信号变化的效果。基于双光子染料低细胞毒性、高穿透性等优点，我们设计并合成了一种以1,8-萘酰亚胺为母核的双光子的甲醛类荧光探针，这类探针能够成功检测甲醛溶液以及细胞内甲醛浓度的变化。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种1,8-萘酰亚胺的新型双光子甲醛类荧光探针及其制备方法与用途。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种式(I)所示双光子甲醛荧光探针，本专利技术还提供一种所述双光子甲醛荧光探针的制备方法，所述方法为：将式(4)所示化合物溶于甲醇中，冰浴至0℃，加入7mol/L氨甲醇溶液，0℃下反应半小时，随后加入丙烯基硼酸邻二叔醇酯，室温反应过夜，反应液分离纯化，获得所述双光子甲醛荧光探针；进一步，所述式(4)所示化合物与丙烯基硼酸邻二叔醇酯物质的量之比为1:2，所述氨甲醇溶液用量以氨物质的量计，所述式(4)所示化合物与氨物质的量之比为1:10。进一步，所述甲醇体积用量以式(4)所示化合物物质的量计为10mL/mmol。进一步，所述反应液分离纯化方法为：反应液减压旋蒸去除溶剂，取浓缩物进行硅胶柱分离，以体积比20：1的二氯甲烷甲醇混合液为洗脱剂，收集目标组分，干燥，获得所述双光子甲醛荧光探针。本专利技术还提供一种所述双光子甲醛荧光探针在检测甲醛中的应用，所述甲醛为5μmol/L～5mmol/L甲醛水溶液(优选0.25～5mM)，所述甲醛为细胞内5μmol/L～5mmol/L甲醛(优选2～5mM)，所述细胞为子宫颈癌细胞HeLa。所述甲醛检测限为5μmol/L。当检测溶液中甲醛时，所述检测方法是将探针溶液加入磷酸缓冲液(10mM pH＝7.4)中，再加入甲醛水溶液，所述探针溶液为1mM探针二甲基亚砜溶液，所述探针溶液与甲醛水溶液体积比为1:2，所述甲醛终浓度为5μmol/L～5mmol/L，即检测范围为5μmol/L～5mmol/L；当检测细胞中甲醛时，检测范围为5μmol/L～5mmol/L。反应路线如下：本专利技术所述化合物(I)可作为双光子荧光探针，应用于甲醛的荧光检测。所述的甲醛浓度的荧光检测的方法为：以化合物(I)作为荧光探针，与PBS缓冲溶液中的甲醛进行反应，生成中间产物，随后2-氮杂-柯普重排以及水解，生成荧光物质4，测定在激发为350nm下的荧光强度变化，从而获得甲醛浓度。其次，以化合物(I)作为荧光探针，与HeLa细胞进行孵化，然后加入外源甲醛进行荧光成像，激发波长为720nm，发射波长为425nm到470nm。本专利技术荧光探针的结构中以3号位的取代基的改变，实现推-拉电子能力的变化，从而达到吸收光谱以及发射波谱蓝移的效果。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术选用的1,8-萘酰亚胺结构是个双光子荧光团，具有良好的光稳定性以及很大的斯托克位移。我们合成的探针对甲醛水溶液具有很好的特异性，在生物细胞成像时选用长波长的激发波长，降低细胞自身荧光背景，穿透能力强，对细胞损伤小，能够检测细胞内甲醛的浓度，最低检测限为5μM，为研究细胞
中甲醛的生理作用提供一种有效的研究工具。(四)附图说明图1为本专利技术中探针(I)的核磁氢谱。图2为本专利技术中探针(I)的核磁碳谱。图3为本专利技术中探针(I)在pH为7.4条件下加入0mM和5mM甲醛水溶液浓度的紫外吸收光谱，曲线(I)+甲醛是指探针(I)加入5mM甲醛水溶液，曲线(I)是指探针(I)加入0mM甲醛水溶液。图4为本专利技术中探针(I)在pH为7.4激发波长为450nm条件下加入不同甲醛水溶液浓度下的荧光光谱，曲线(I)是指探针(I)加入0mM甲醛水溶液。图5为本专利技术中探针(I)在pH为7.4激发波长为350nm条件下加入不同甲醛水溶液浓度下的荧光光谱。图6为本专利技术中探针(I)在pH为7.4激发波长为350nm发射波长为510nm条件下加入0.5mM甲醛水溶液下的时间荧光变化图。图7为本专利技术中探针(I)在pH为7.4激发波长为350nm条件下加入甲醛和不同生物相关活性小分子的荧光光谱。图8为本专利技术中探针(I)在不同pH值激发波长为350nm发射波长为510nm条件下加入0mM和5mM甲醛浓度的荧光变化，(I)是指探针(I)加入0mM甲醛水溶液。图9为本专利技术中探针(I)和化合物4的密度泛函数计算。图10为本专利技术中探针(I)在pH为7.4的条件下加入1mM后不同时间段的高效液相色谱图。图11为本专利技术中探针(I)在子宫颈癌细胞(HeLa)中的双光子共聚焦荧光成像效果图，(a)(d)(g)分别表示激发光为720nm时0、2、5mM甲醛浓度孵化下细胞的双光子共聚焦荧光成像效果图；(b)(e)(h)
分别表示0、2、5mM甲醛浓度孵化下细胞的细胞明场效果图；(c)(f)(i)分别表示(a)和(b)、(d)和(e)、(g)和(h)的叠加效果图。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：参照文献(J.Fang,J Am Chem Soc,2015,137,757-769，S.-K.Chang,Dyes and Pigments)的合成方法，按照合成路线分别合成结构式(2)、(3)和(4)的中间产物。实施例1探针(I)的合成在50mL的圆底烧瓶中，加入148mg化合物4(0.5mmol)溶于5mL甲醇中，冰浴至0℃，加入0.72mL氨甲醇溶液(7mol/L 5mmol)，0℃下反应半小时，随后加入168mg丙烯基硼酸邻二叔醇酯(1mmol)。反应转至室温且过夜，混合液减压旋蒸去除溶剂，取浓缩物进行硅胶柱分离(以体积比20：1的二氯甲烷：甲醇混合液洗脱)，得到产物118mg，产率70％。核磁氢谱见图1，核磁碳谱见图2。1H NMR(500MHz,d6-DMSO)δ:8.43(d,J＝7.8,1H),8.25(d,J＝7.0,1H),8.03(s,1H),7.35(t,J＝7.6,1H),5.72(ddt,J＝13.8,10.1,6.8,1H),5.06(dd,J＝25.4,13.6,2H),4.50-4.32(m,1H),4.09-3.94(m,2H),2.88-2.75(m,1H),2.74-2.63(m,1H),1.64-1.49(m,2H),1.39-1.26(m,2H),0.92(t,J＝7.4,3H)。13C NMR(126MHz,d6-DMSO)δ:175.4,164本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种式(I)所示双光子甲醛荧光探针，

【技术特征摘要】
1.一种式(I)所示双光子甲醛荧光探针，2.一种权利要求1所述双光子甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于所述方法为：将式(4)所示化合物溶于甲醇中，冰浴至0℃，加入7mol/L氨甲醇水溶液，0℃下反应半小时，随后加入丙烯基硼酸邻二叔醇酯，室温反应过夜，反应液分离纯化，获得所述双光子甲醛荧光探针；3.如权利要求2所述所述双光子甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于所述式(4)所示化合物与丙烯基硼酸邻二叔醇酯物质的量之比为1:2，所述氨甲醇溶液用量以氨物质的量计，所述式(4)所示化合物与氨物质的量之比为1:10。4.如权利要求2所述所述双光子甲醛荧光探针的制备方法，其特征在于所述甲醇体积用量以式(4)所示化合物物质的量计为10mL/...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱勍，谢振达，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33