一种用于次氯酸检测的双光子可逆型荧光探针FO-PSe及其制备方法和应用技术

本发明专利技术设计合成了一种用于次氯酸检测的双光子可逆型荧光探针FO-PSe及其制备方法和应用。以易得的已合成的两种化合物为起始原料，经过一步简易、高效的合成反应制得该探针，且后处理容易、纯化简便。该荧光探针具有双光子性质，能有效地降低背景荧光干扰，而且对次氯酸具有可逆性，能动态可逆的检测次氯酸的浓度。将其用于活细胞及活体成像得到了良好效果，而且实现了老鼠腹腔部位不同深度次氯酸的成像分析。本发明专利技术探针结构新颖、光物理性质优良。为研究活细胞及活体内次氯酸的功能及生物学意义提供了一种良好的荧光工具。

Two photon reversible fluorescent probe FO-PSe for detection of hypochlorite and preparation method and application thereof

The present invention is designed and synthesized a two-photon reversible fluorescent probe FO-PSe, and its preparation method and application. The synthesized two kinds of compounds were used as starting materials. The probe was prepared by a simple and efficient synthetic reaction. The fluorescent probe has two photon properties, which can effectively reduce the background fluorescence interference, and can be used to dynamically detect the concentration of hypochlorite. It has been used in living cells and in vivo imaging, and has achieved good results. The invention has the advantages of novel structure and excellent optical and physical properties. The present study provides a good fluorescence tool for the study of the function and biological significance of hypochlorite in living cells and living organisms.

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于合成领域，特别涉及一种用于次氯酸检测的双光子可逆型荧光探针FO-PSe及其制备方法和应用。
技术介绍
：次氯酸在人体内是重要的活性氧之一，它在生物体的生理和病理等方面都起着至关重要的作用。在生物体中过氧化氢和氯离子在髓过氧化物酶的催化作用下能够发生化学反应，产物次氯酸根及其质子化的形式即次氯酸在生理条件下存在于生物体内。次氯酸是一种具有强亲核能力的的氧化性物质，它可以与生物体内的多种分子如RNA,DNA,脂肪酸，胆固醇及多种蛋白质发生反应。次氯酸最显著的作用是其强抗菌性，它是通过把某种病毒接触反应中所需的酶氧化掉，从而达到杀菌抗菌的目的。如果次氯酸的浓度出现异常，就会对生命体系造成极大的破坏，同时引发一些严重的疾病，如关节炎，动脉硬化及一些癌症等，因此发展用于次氯酸检测的工具是很有意义的。近几年来，已报道了HClO的荧光探针数种，如DCFH、DHR(参见文献：A.Bizyukin，etal，Bull.Exp.Biol.Med.1995，119，347.)、APF(文献：T.Nagano，J.Biol.Chem.2003，278，3170.)、MitoAR(文献：T.Nagano.J.Am.Chem.Soc.2007，129，10324.)等，但以上探针除了能够检测HClO，对其他的活性氧物种亦有不同程度的荧光响应。由于每种活性氧都有其各自独特的生理或病理作用，因此对专一性强的HClO荧光探针的需求显得尤为迫切。已报道的另外一些HClO探针中，有的需在pH12的苛刻的操作条件(文献：H.M.Ma，Chem.Eur.J.2008，14，4719.)，或水溶性差(文献：W.Tan，etal，Chem.Eur.J.2009，15，2305.)，无法真正应用于生物体系中。目前，能够真正应用于细胞中HClO检测的荧光探针极少，需在繁琐苛刻的条件下多步骤高成本制备而得(文献：T.Nagano，J.Am.Chem.Soc.2007，129，7313.；文献：J.Tae，Org.Lett.2009，11，(4)，859.；文献：R.Weissleder，P.Libby，Chem.Biol.2007，14，1221.)。荧光法具有高灵敏度、高选择性、简单方便、实时原位检测等优点，使其在生命和环境科学、分析化学等领域有相当广泛的应用前景。因此设计高灵敏度、高选择性、快速识别的新型次氯酸荧光探针得到人们越来多的重视，同时也成为一项非常重要的课题。双光子荧光探针被广泛用于生物成像领域，由于其对生物组织样品较低的光损伤、较深的组织穿透能力、较低的生物背景荧光干扰等优点。因此，新型的双光子荧光探针的合成和发展是非常必要的，尤其可逆型的双光子的设计、合成还是非常具有挑战性的。
技术实现思路
本专利技术目的在于弥补目前次氯酸检测中，双光子可逆型荧光探针较少的状况，简易、高效地合成了一种双光子可逆型荧光探针(FO-PSe),可逆是指荧光探针(FO-PSe)可与次氯酸发生氧化反应，荧光增强；之后又可与GSH发生还原反应，荧光减弱，如此循环多次。将其成功应用于活细胞及活体中次氯酸的成像分析，而且可以实现活体中腹腔部位不同深度次氯酸的成像分析，基本无背景荧光，效果良好。一种用于次氯酸检测的双光子可逆型荧光探针FO-PSe，其结构式为：上述的探针FO-PSe的制备方法，包括如下步骤：取原料1和2溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入适量的二硫苏糖醇和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，于75-100℃反应25-40h，萃取、干燥、二次溶解、过柱分离，即得；所述原料1的结构式为：所述原料2为二苯基二硒。优选的，上述原料1和2、二硫苏糖醇、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、N,N-二甲基甲酰胺物质的量之比为1-2:3-6:5-10:10-15。优选的，上述过柱分离所用洗脱剂体积比为石油醚：二氯甲烷5-9:1-2(V/V)。上述的探针FO-PSe可用于检测生物体内或外的次氯酸含量。上述的探针FO-PSe可用于定量检测次氯酸。上述的探针FO-PSe可用于活细胞和斑马鱼及小鼠的活体成像。上述的探针FO-PSe可用于激光共聚焦成像。本专利技术还提供了一种用于次氯酸检测的双光子激光检测系统，包括双光子激光共聚焦显微镜和上述的探针FO-PSe。本专利技术还发现：探针FO-PSe检测生物体内或外的次氯酸时，优选的激发光的波长为425-450nm或800～825nm。本专利技术设计合成了一种用于次氯酸检测的双光子可逆型荧光探针，命名为FO-PSe，它具有双光子性质，并且是可逆型的荧光探针。我们成功地将其应用于活细胞及活体内次氯酸的研究，取得了良好的效果。其简易、高效的合成步骤及优良的光物理性质属于合成与
通常，可以将染料分子溶解在缓冲液或由DMSO等水溶性有机溶剂中，然后加入适当缓冲液及其他有机试剂进行测试。我们分别研究了探针FO-PSe在pH＝7.4缓冲水溶液及各种常见的有机试剂中的光物理性质并将其用于活细胞和斑马鱼及小鼠活体成像实验。活细胞和斑马鱼活体的染色方法是将探针加入培养好的活细胞或斑马鱼培养液中，孵育一定的时间去除孵育液，并用PBS缓冲液洗涤3次，然后进行激光共聚焦成像)。小鼠活体染色的方法是用注射器将探针分子注射到老鼠腹腔部位，然后进行激光共聚焦成像。本专利技术利用以前已有的原料中间体1和2，由一步简易、高效合成，最后经过薄层色谱柱分离得到探针FO-PSe。本专利技术的有益效果是：(1)该探针分子具有双光子性质,有效地降低了自吸收，提高了成像准确度。(2)该探针对次氯酸具有可逆性，可以动态可逆的检测生物体系中次氯酸的浓度变化。(3)活细胞和斑马鱼及小鼠染色效果良好。染色时间较短(10min)，染色效率较高。(4)合成步骤相对简单、产率较高、容易纯化。附图说明图1是本专利技术新型荧光探针的激发光谱及发射光谱谱图，其中a为激发光谱，激发波长为425nm,b为发射光谱，发射波长为530nm；横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。图2是本专利技术新型荧光探针与次氯酸作用前后的双光子荧光发射谱图，其中a为荧光探针与次氯酸作用前的双光子发射光谱，b为荧光探针与次氯酸作用后的双光子发射光谱；横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度。图3是本专利技术新型荧光探针(10μM)与加入不同浓度的次氯酸(0-100μM)，单光子荧光光谱。Inset:探针的荧光强度与次氯酸浓度的线性相关性。图4是本专利技术新型荧光探针细胞成像图，即与巨噬细胞单本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于次氯酸检测的双光子可逆型荧光探针FO‑PSe，其特征在于，结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种用于次氯酸检测的双光子可逆型荧光探针FO-PSe，其特征在于，结构式为：
2.权利要求1所述的探针FO-PSe的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
取原料1和2溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液，加入二硫苏糖醇和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十
一碳-7-烯，于75-100℃反应25-40h，萃取、干燥、二次溶解、过柱分离，即得；
所述原料1的结构式为：
所述原料2为二苯基二硒。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述原料1和2、二硫苏糖醇、1,8-二氮杂双
环[5.4.0]十一碳-7-烯、N,N-二甲基甲酰胺物质的量之比为1-2:3-6:5-10:10-15。
4.如权利要求2所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：张卫，刘伟，李平，唐波，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37