活体动物双光子激发延时检测荧光成像分析方法及设备技术

本发明专利技术公开了一种活体动物双光子激发延时检测荧光成像分析方法及设备，用于分析动物体内组织和器官中荧光纳米探针(或荧光纳米载药体模拟探针)的分布、荧光强度或探针浓度随时间变化动力学性质，以红光或近红外脉冲激光双光子激发体内荧光纳米探针发光，以延时检测荧光成像方式探测体内特定部位荧光强度及其随时间变化动力学性质，具有成像分析深度大、可靠性高、检测灵敏度高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物在体荧光影像分析技术，特别涉及一种活体动物体内纳米载药体模拟探针或荧光纳米探针的分布及输运动力学性质的荧光成像分析方法，实施所述分析的设备，以及该方法和设备在纳米载药体肿瘤靶向动力学性质表征中的应用。
技术介绍
动物在体荧光影像技术具有灵敏度高、损伤小等特点，已发展成为活体动物成像的一种常用方法，被广泛用于生命科学、生物医学和药物研发等领域[V.Wagner,A.Dullaart,A.Bock,A.Zweck,The emerging nanomedicine landscape.Nature Biotechnology.2006,24,1211-1217.]。活体荧光成像系统在生物医学、生理分析及药物研发等领域的许多研究中有广阔的应用前景。然而，活体动物荧光成像技术也面临着许多难题有待解决，例如，在可见光/紫外激发光源照射下，活体动物的皮肤、毛发等组织会产生较强的自发荧光，它们与常用的标记探针的荧光光谱重叠，导致信噪比大幅降低，严重影响检测的灵敏度和准确性；另一方面，不同类型的细胞和组织对光的吸收和散射能力不同，活体动物组织结构及体液运动情况复杂，导致了特异荧光信号的衰减、信号失真等问题。此外，一些有毒性的探针不宜在活体中使用，而小分子荧光探针发光强度较低，发光性质受环境影响显著，光稳定性和化学稳定性不够高等问题也是制约活体荧光成像技术发展的重要因素。如何克服活体动物自发荧光的干扰，增加探测深度，提高所采集生化信息的准确性，是活体荧光影像技术发展中具有挑战性的科学技术难题。传统荧光成像技术利用连续或调制光源激发活体组织或细胞中的特异性荧光探针发光实现荧光成像。组织、细胞和体液对激发光的散射和自发荧光等背景荧光与探针发光混在一起，对特异性靶标的影像产生较大的干扰。一般通过与探针荧光匹配的窄带滤光片压制激发光散射和背景荧光来提高活体荧光影像分析的灵敏度。但是，在活体动物体内大深度标记下需要使用较高激发光强时，背景荧光的干扰难以克服。背景荧光干扰导致图像信噪比下降，严重时将湮没特异性荧光信号，大大制约了活体动物荧光成像技术的应用。利用激发光散射和生物自发荧光等背景荧光与荧光探针发光之间的发光寿命差异，实现时间分辨荧光成像是一个很好的解决方案。由于激发光散射的持续时间与激发光脉冲宽度大致相当，可以通过延时检测技术将其避开。但是，背景荧光寿命和绝大多数荧光探针分子寿命均在纳秒量级，如，蛋白质、色素和大多数荧光靶标的荧光寿命一般不超过20ns，寿命差异较小，相应的延时检测
技术仅适合于显微寿命成像，难以应用于活体动物的快速、大视场成像。近年来，基于染料分子独特的荧光光谱，通过比较标准荧光光谱去除本底荧光干扰，发展了光谱拆分活体成像技术，在一定程度上提高了成像的准确度和灵敏度[X.H.Gao,Y.Y.Cui,R.M.Levenson,L.W.K.Chung,S.M.Nie,In vivo cancer targeting and imaging withsemiconductor quantum dots,Nature Biotechnology,2004,22,969-976.]。但由于光谱成像或光谱拆分成像是由多帧含有光谱信息的图像拼合而成，高度依赖于图像的计算解析技术，在背景光较强时，难以保证探针特征光谱拆分的可靠性。生物分子和普通荧光染料的发射光谱都很宽，彼此严重交叠，在准确获取目标物的特征光谱方面仍有相当难度。由于动物种属、不同个体间以及不同组织的差异等原因，光谱拆分技术在实际应用中也会产生一些假象。因此，采用新的背景光抑制原理与技术是进一步提高检测灵敏度与可靠性的关键所在。动物组织和细胞中存在与激发光波长四次方成反比的瑞利散射，以及其它形式的散射，强烈的散射和吸收使激发光难以有效到达深层靶标，给实现其荧光成像带来很大困难。生物组织、细胞和体液对610-900nm波段的光散射和吸收相对较小，因而该波段被称为生物组织激发和检测的光学窗口。双光子激发荧光一般使用波长为750-1000nm的飞秒近红外激光作为激发光源，荧光标记探针同时吸收两个光子达到激发态。由于双光子激发几率与激发光强两次方成正比，焦点以外的发光物质被激发的几率大为降低。然而，动物体内的某些物质也会因双光子效应而产生很强的背景荧光，导致信噪比下降，而本专利技术人的研究表明，动物表皮在飞秒激光激发下会产生很强的背景荧光或磷光，其寿命也长于普通荧光染料的荧光寿命，采用普通双光子激发成像方式难以获得体内发光标记物的准确信息。另一方面，现有双光子共焦成像技术是在单光子共焦成像技术和飞秒激光光源基础上，针对可见光谱区的双光子荧光染料开发的。该技术采用逐点扫描成像，因而不适用于大视场下的活体动物成像。同时由于逐点扫描的工作模式，在成像时间的限制下，每点的工作时间必须是纳秒量级的，这使此类技术难以应用于活体动物高效双光子激发成像分析。纳米载药体已成为一种有效的新型给药方式，在肿瘤治疗中发挥了积极作用。然而纳米载药体的性能取决于其组成、尺寸、表面靶向分子结构，进一步优化纳米载药体的性能，需要定量理解其在活体动物体内的肿瘤靶向动力学性质及在主要器官中的分布与上述结构特征之间的关系。为高效、准确地获得上述信息，本专利技术人提出采用双光子激发延时检测荧光成像的方法对注入活体动物体内的、具有长发光寿命且双光子激发和荧光发射波长均处于生物透光窗口(600-1000nm)的纳米载药体模拟探针(下称荧光纳米载药体模拟探针)的分布和动
力学性质进行定量分析的方法。由于动物表皮血管或体内组织中距光源更近的纳米载药体模拟探针将首先被激发，而在普通照射模式下，随着探测深度的增加，激光功率密度会显著减小，双光子激发发光强度下降，因此在大视场(例如一维尺寸为1mm-10厘米)下要对活体动物体内肿瘤或某些特定器官中的纳米载药体模拟探针进行无损或非介入式荧光分析，需要减小或消除处于皮肤或待测组织、器官周围的上述探针产生的荧光干扰。
技术实现思路
为解决上述难题，本专利技术提供一种双光子激发延时检测荧光动物成像分析技术、设备与应用，以实现在大视场下，增大动物体内荧光纳米载药体模拟探针成像分析深度，消除自发荧光与背景光的干扰，同时减小来自动物表皮和目标探测部位周围组织中荧光纳米载药体模拟探针荧光的干扰，提高所述成像分析的可靠性。本专利技术的技术方案如下：一种活体动物体内组织和器官中荧光纳米探针的分布、荧光强度或探针浓度随时间变化动力学性质的荧光成像分析方法，其特征在于，以红光或近红外脉冲激光双光子激发体内荧光纳米探针发光，以延时检测的方式探测体内受激发部位的荧光，进行成像。上述荧光成像分析方法中，所述荧光纳米探针可为动物体内的组织或器官中的荧光纳米载药体模拟探针。通过该方法可以对荧光纳米探针在动物体内的分布、荧光强度或探针浓度随时间变化动力学性质进行检测分析。本专利技术的荧光成像分析方法的成像视场至少有一维尺寸在1毫米至10厘米范围内。通过电动平移台驱动检测设备对成像部位进行激发光斑的可控扫描，实现大的成像视场。本专利技术的荧光成像分析方法中，优选的，通过红光或近红外飞秒脉冲激光激发荧光纳米探针中的双光子敏化稀土发光配合物发光，所述红光或近红外飞秒脉冲激光的波长在61本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光成像分析方法，用于分析活体动物体内组织和器官中荧光纳米探针的荧光强度和分布，其特征在于，以红光或近红外脉冲激光双光子激发体内荧光纳米探针发光，以延时检测的方式探测体内受激发部位的荧光，进行成像。

【技术特征摘要】
2015.02.16 CN 20151008513801.一种荧光成像分析方法，用于分析活体动物体内组织和器官中荧光纳米探针的荧光强度和分布，其特征在于，以红光或近红外脉冲激光双光子激发体内荧光纳米探针发光，以延时检测的方式探测体内受激发部位的荧光，进行成像。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，成像的视场至少有一维尺寸在1毫米至10厘米范围内。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用荧光探测器延时检测体内受激发成像部位的荧光，所述延时为激发光脉冲激发后到荧光探测器开启之前的时差，该时差为10ns至500μs；延时检测荧光的时间窗口为10ns至100ms。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过红光或近红外飞秒脉冲激光激发荧光纳米探针中的双光子敏化稀土发光配合物发光，所述红光或近红外飞秒脉冲激光的波长在610-1100纳米范围内；所述稀土发光的波长位于600至1050纳米范围内。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述荧光纳米探针的发光体基本上由基质材料和具有双光子敏化稀土发光性能的稀土配合物组成，所述基质材料是由主链为碳氢链、侧基为羧基和疏水基团构成的高分子化合物；所述稀土配合物为近红外光激发下发射可见光或近红外光的稀土配合物。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述稀土配合物选自如下式I、式II和式III结构通式所示化合物中的一种或多种；式I、式II和式III中，La代表铕、镱或钕离子；R1和R2各自独立为C1～C4烷基；R3、R4、R5、R6、R7和R8各自独立为甲基或H。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基质材料与所述稀土配合物的质量比为1～10,000∶1；组成所述基质材料的高分子化合物的数均分子量为1,500～150,000；所述高分子化合物中，羧基基团占所述高分子化合物总质量的0.01％～40％；由基质材料和稀土配合物组成的发光体为发光纳米粒子，其粒径为5～200纳米。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，激发荧光纳米探针的激发光源位于动物体外，采集体内受激发成像部位荧光的荧光探测器也位于体外；或者，所述荧光纳米探针的光激发和荧光信号采集是以将导光管插入体内并接近探测部位的方式进行，所述导光管的前端位置和探测部位的距离为0.1至3厘米。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，激发、检测目标部位位于动物皮肤以下，使激发光的焦点位于动物皮肤以下，且激发光焦点处的光功率密度是皮肤处的光功率密度的2至1000倍，优选为10至1000倍。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，以两条功率密度均匀的平场线形飞秒脉冲激光束在活动物皮下聚焦成一条平场线形脉冲激光束，并以此激光束扫描的方式激发荧光纳米探针；或者，以环形带状飞秒脉冲激光束射入动物皮下待测部位聚焦的方式激发荧光纳米探针；然后，利用时序控制器控制荧光探测器延时采集动物体内被激发的荧光纳米探针的荧光信号。11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对受激发成像部位的光致发光进行光谱采集，所述光谱采集的波长范围在600～1000纳米范围内。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在时序控制器下，利用平场线形聚焦激光束对动物体内进行扫描激发，以光谱仪和ICCD以延时探测的方式采集各受激发部位的光致发光光谱；或者，在时序控制器下，利用环形带状激光束在动物体内进行聚焦激发，以光谱仪和ICCD以延时探测的方式采集各受激发位置的光致发光光谱。13.一种研究纳米载药体在动物体内分布、输运或肿瘤靶向动力学性质的方法，对荷瘤动物或正常动物静脉注射荧光纳米载药体模拟探针，在注射前后分别对待测部位利用权利要求1～12任一所述的方法进行双光子激发延时光谱采集检测，以注射所述探针之前的光谱为背景，利用光谱差减方法，获得注射所述探针后动物体内受测部位探针的光谱信号，以及该信号随时间变化的动力学性质。14.一种研究纳米载药体在动物体内分布、输运或肿瘤靶向动力学性质的方法，利用权利要求1～12任一所述的荧光成像分析方法进行，包括以下步骤：1)对动物静脉注射荧光纳米载药体模拟探针；2)以飞秒脉冲激光激发动物体内一个正常非脏器部位血管中的所述探针发光，以延时信号采集的方式记录该部位荧光强度随时间的变化；3)以飞秒脉冲激光激发动物体内载药体靶向目标部位中的具有载药体靶向性的所述探针发光，以延时信号采集的方式记录该目标部位荧光强度随时间的变化；4)以方程Y＝A1e-t/τ1+C拟合步骤2)中探针发光强度随时间衰减的数据；5)以方程Y＝Aae-t/τ1+Abe-t/τ2+B拟合步骤3)中探针发光强度随时间衰减的数据，以Ab/(Aa+Ab)表征所述探针的载药体靶向性，以1/τ1和1/τ2表征因免疫系统清除或非特异性吸附导致所述探针在探测部位的浓度下降速率，以τ3表征所述探针在靶向部位平均滞留时间；其中C和B为常数或时间的函数。15.一种荧光成像分析设备，用于分析活体动物体内组织和器官中荧光纳米探针的分布和荧光强度，所述设备包括飞秒激光器、荧光探测器、时序控制器...

【专利技术属性】
技术研发人员：王远，付利民，张建平，杨文云，文学，刘禹辰，
申请(专利权)人：北京大学，中国人民大学，
类型：发明
国别省市：北京;11