【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及纳米抗体类药物，尤其涉及一种温度响应性纳米抗体偶联物及其制备方法和应用。
技术介绍
1、随着对单克隆抗体类药物的深入研究，其局限性也逐步被发现，例如单克隆抗体类药物的分子量较大，稳定性低，对肿瘤组织的穿透性差，只能针对分泌型和细胞膜表面的抗原发挥作用；单克隆抗体中的片段可结晶区(fc)往往需要人源化处理，以降低其免疫原性；而且fc受体普遍存在，也降低了单克隆抗体与目标受体的结合几率；另外，单克隆抗体的表达往往借助于真核系统，纯化依赖于色谱纯化技术，因此其生产纯化的成本较高。
2、纳米抗体作为一种替代传统单克隆抗体的抗体形式，弥补了传统单克隆抗体的不足。纳米抗体来源于单克隆抗体的重链可变区，是目前已知的最小的抗体片段，但其仍保持了较高的与受体结合的能力，并且与单克隆抗体相当。由于纳米抗体分子量较小，其对组织的穿透能力较强，可以识别致密组织或者实体瘤内部隐藏的抗原表位。除此之外，与单克隆抗体相比，纳米抗体有着免疫原性较低，稳定性高的优势，并且纳米抗体的表达仅需要借助微生物体系，更易于生产。
3、尽管有着诸多优势，纳米抗体最主要的缺点是其半衰期较短，更容易通过肾脏的过滤功能被清除，极易被代谢和降解。而由于免疫疗法往往需要高剂量来达到临床疗效，易被快速清除的纳米抗体往往需要更高的注射剂量，采用多次注射的方式来达到临床效果，因此限制了其实际应用。目前已有多种策略来解决纳米抗体半衰期短的问题，如来源于igg片段的fc修饰，聚乙二醇修饰(polyethylene glycol，pegylation)，糖基
技术实现思路
1、为解决纳米抗体类药物在临床应用中存在的代谢快、半衰期短的技术问题，本专利技术提供一种温度响应性纳米抗体偶联物及其制备方法和应用。
2、具体地，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供一种温度响应性纳米抗体偶联物，所述纳米抗体偶联物包含纳米抗体类药物和温敏性类弹性蛋白多肽；所述温敏性类弹性蛋白多肽的氨基酸序列包含(gxgvp)n，其中，x为除脯氨酸以外的任意一种天然氨基酸，n为不小于10的整数。
4、类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides，elps)来源于哺乳动物的弹性蛋白原，是一类对温度敏感的生物大分子，具有温敏可逆相变的特性，可作为生物材料，具有生物相容性、无毒无免疫原性、可生物降解、对温度敏感、精准设计和可快速纯化等优势。可逆相变是指类弹性蛋白在可溶和聚集两相之间，在一定温度时的相平衡压力下发生的相变化，也就是说，若环境温度低于其相变温度，该多肽在水溶液中高度可溶；在环境温度高于相变温度时，富含甘氨酸的多肽开始聚集，形成elp的聚集物，并且该相变过程是可逆的。水溶液中的elps在相转变温度(transition temperature，tt)附近可发生可逆的聚集溶解。当温度低于tt时，elps呈现可溶的状态；当温度高于tt时，elps发生聚集，形成不溶的聚集状态，经注射可在原位形成药物储库，进而达到药物缓慢释放的目的。elp的相变温度可随x氨基酸的极性和重复单元的数量而发生改变，规律如下：重复单元数量(n)数量越多，相变温度(tt)越低；x氨基酸的极性越高，相变温度(tt)越低。
5、本专利技术发现，将类弹性蛋白多肽与半衰期较短的纳米抗体类药物进行偶联，能够实现纳米抗体类药物的温度依赖性可控释放，可显著改善纳米抗体类药物半衰期短、生物利用率低等问题。与传统的fc修饰相比，elp融合可提高纳米抗体类药物对肿瘤的穿透能力及富集能力，其生物安全性也得到显著提升。
6、本专利技术的纳米抗体类药物在偶联类弹性蛋白多肽后，在给药部位可形成“药物储库”。“药物储库”是指纳米抗体偶联物经高温触发析出，在给药部位形成富含elp的聚集体。给药部位可以根据疾病种类、治疗部位和蛋白药物种类等及进行选择，包括但不限于皮下给药、腹腔给药或者肿瘤内部给药。
7、上述温度响应性纳米抗体偶联物中，x为缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸中的任意一种，10≤n≤200；
8、优选地，所述类弹性蛋白多肽的响应温度为20-36℃。
9、优选地，上述温度响应性纳米抗体偶联物中，x为缬氨酸，30≤n≤150。
10、本专利技术发现，针对纳米抗体，采用包含(gvgvp)n序列的类弹性蛋白多肽更有利于延长纳米抗体的半衰期，改善其药代动力学，提高其生物利用率。
11、进一步优选地，上述温度响应性纳米抗体偶联物中，x为缬氨酸，60≤n≤120。
12、在本专利技术的一些实施方式中提供一种温度响应性纳米抗体偶联物，其包含纳米抗体类药物和温敏性类弹性蛋白多肽；所述温敏性类弹性蛋白多肽的氨基酸序列包含(gxgvp)n，其中，x为缬氨酸，n＝90。
13、本专利技术所述的类弹性蛋白多肽可采用基因工程领域常规的合成方法制备和表达。
14、本专利技术中，所述纳米抗体类药物为轻链缺失的重链抗体(hcab)、重链抗体可变区(vhh)或单域抗体(sdab)。
15、优选地，所述纳米抗体类药物的分子量为1-300kda。
16、进一步优选地，所述纳米抗体类药物的分子量为12-300kda。分子量为12-300kda的纳米抗体类药物的分子量较小，容易被体内蛋白酶降解和经肾脏排出，循环半衰期非常短，需要频繁给药以维持较高的血药浓度，尤其适合与前述的温敏性类弹性蛋白多肽进行偶联，避免蛋白酶降解和肾脏排出，延长药物的半衰期。
17、优选地，所述纳米抗体类药物的靶点为选自白细胞分化抗原3(cd3)、白细胞分化抗原19(cd19)、白细胞分化抗原20(cd20)、白细胞分化抗原47(cd47)、人表皮生长因子2(her2)、表皮生长因子受体(egfr)、血管内皮细胞生长因子(vegf)、血管内皮细胞生长因子受体(vegfr)、细胞毒性t淋巴细胞抗原(ctla-4)、b细胞成熟抗原(bcma)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-1(il-1)、白细胞介素-2(il-2)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-6受体(il-6r)、白细胞介素-12(il-12)、白细胞介素-17(il-17)、白细胞介素-23(il-23)、整合素(integrin)、程序性死亡受体(pd1)、程序性死亡受体配体(pdl1)、sars-cov-2中的至少一种。
18、进一步优选地，所述纳米抗体类药物是与免疫检查点特异性结合并具有高亲和力的抗体片段，例如，免疫检查点pd1、pdl1、表皮生长因子受体her2、egfr、cd47本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种温度响应性纳米抗体偶联物，其特征在于，所述纳米抗体偶联物包含纳米抗体类药物和温敏性类弹性蛋白多肽；
2.根据权利要求1所述的温度响应性纳米抗体偶联物，其特征在于，X为缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸中的任意一种，10≤n≤200；
3.根据权利要求1或2所述的温度响应性纳米抗体偶联物，其特征在于，所述纳米抗体类药物为轻链缺失的重链抗体、重链抗体可变区或单域抗体；
4.根据权利要求1～3任一项所述的温度响应性纳米抗体偶联物，其特征在于，所述纳米抗体类药物与所述温敏性类弹性蛋白多肽通过连接体连接；
5.根据权利要求1～4任一项所述的温度响应性纳米抗体偶联物，其特征在于，所述温度响应性纳米抗体偶联物包含PDL1纳米抗体、连接体和温敏性类弹性蛋白多肽；
6.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～5任一项所述的温度响应性纳米抗体偶联物。
7.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求6所述的核酸分子或表达权利要求1～5任一项所述的温度响
8.权利要求1～5任一项所述的温度响应性纳米抗体偶联物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将编码所述温度响应性纳米抗体偶联物的核酸分子导入宿主细胞，表达所述温度响应性纳米抗体偶联物，再经提取和纯化制备得到。
9.权利要求1～5任一项所述的温度响应性纳米抗体偶联物或权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的生物材料在制备药物中的应用；
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1～5任一项所述的温度响应性纳米抗体偶联物。
...【技术特征摘要】
1.一种温度响应性纳米抗体偶联物，其特征在于，所述纳米抗体偶联物包含纳米抗体类药物和温敏性类弹性蛋白多肽；
2.根据权利要求1所述的温度响应性纳米抗体偶联物，其特征在于，x为缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸中的任意一种，10≤n≤200；
3.根据权利要求1或2所述的温度响应性纳米抗体偶联物，其特征在于，所述纳米抗体类药物为轻链缺失的重链抗体、重链抗体可变区或单域抗体；
4.根据权利要求1～3任一项所述的温度响应性纳米抗体偶联物，其特征在于，所述纳米抗体类药物与所述温敏性类弹性蛋白多肽通过连接体连接；
5.根据权利要求1～4任一项所述的温度响应性纳米抗体偶联物，其特征在于，所述温度响应性纳米抗体偶联物包含pdl1纳米抗体、连接体和温...
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