本发明专利技术公开了一种利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法，包括：1）PCR扩增抗性基因片段，其中在引物上添加目的重组基因的同源序列；2）抗性基因片段与克隆质粒连接后，转化至大肠杆菌中，经筛选得到克隆质粒；3）以步骤2）得到的克隆质粒为模板，设计引物PCR扩增包含抗性基因、短同源臂以及相邻的上下游序列，得到用于敲除目的基因的同源重组DNA片段；4）将同源重组DNA片段电击转化至含有pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞内；5）转化后的克雷伯氏肺炎杆菌细胞进行培养，筛选获得阳性重组子。该方法不需要将目的重组基因克隆，简单、快捷，且能进行多次基因操作，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因重组的方法，特别是涉及一种。
技术介绍
克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)是一株革兰氏阴性细菌,是克雷伯氏菌属的模式种，属于肠杆菌科。克雷伯氏肺炎杆菌具有生长速度快、可以利用多种碳源和代谢产物丰富等特点，目前主要作为2，3-丁二醇和1，3-丙二醇等化学品的生产用菌，同时克雷伯氏肺炎杆菌可以代谢合成3-羟基丙醛、乙醇、乙偶姻、琥珀酸、乙酸、乳酸、氢气等化学品，克雷伯氏肺炎杆菌还可以作为宿主细胞构建3-羟基丙酸等化合物生产菌，使得克雷伯 氏肺炎杆菌成为一种具有广阔工业化应用前景的微生物。由于克雷伯氏肺炎杆菌特殊的细胞结构和遗传背景，适应于克雷伯氏肺炎杆菌的遗传改造方法操作比较复杂。目前，对克雷伯肺炎杆菌进行基因改造的主要方法有转座子插入突变和同源重组敲除目的基因，而同源重组方法主要涉及到用自杀性质粒和用线性的DNA进行重组。转座子插入突变是利用转座子随机的插入染色体上，使被插入的基因失活。常见的转座子有Tn5、TnlO、Tn916、Tn917等。Chang HY等利用Tn5在克雷伯氏肺炎杆菌CG43的染色体上插入失活得到荚膜缺失的菌株。自杀性质粒的方法是通过向克雷伯氏菌中引入自杀性质粒，使处于质粒上的序列与染色体上的同源序列发生重组，从而实现基因的替换。利用该方法Yang等通过构建自杀质粒转进E. coli SMlO中，然后与产酸克雷伯氏菌M5al接合，进而敲出了产酸克雷伯氏菌 M5al 乳酸脱氣酶基因(IdhA) 。Xu 等通过自杀质粒敲除了克雷伯氏肺炎杆菌HR526的乳酸脱氢酶基因。另外，Horng等利用自杀质粒通过同源重组成功将克雷伯氏肺炎杆菌合成1，3-丙二醇途径 dhaD 和 dhaK 两个基因进行了 失活0线性DNA重组是利用电击转化的方法将线性DNA转入克雷伯氏肺炎杆菌，使得位于线性DNA上的同源序列与染色体上的目的序列发生重组，实现重组替换。Seo等将抗性标记两端带有500bp的同源臂的线性DNA片段转入到克雷伯氏肺炎杆菌Cu中，利用细胞本身具有的重组功能，成功将菌株的甘油脱氢酶基因和1，3-丙二醇氧化还原酶基因进行了敲除。郝健等专利技术了一种利用Red重组酶辅助的用于克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法，在大肠杆菌中利用携带短同源臂的线性DNA与质粒进行重组制备·具有长同源臂的线性DNA，将长同源臂的DNA转入克雷伯氏肺炎杆菌，利用质粒pDK6-red表达Red重组酶的，成功的将克雷伯肺炎杆菌中编码二羟基丙酮激酶的基因进行了敲除。但对于克雷伯氏肺炎杆菌基因重组，已有的技术都采用较长的同源臂，需要将目的基因克隆出来用于构建长同源臂，需要更加简单、方便的方法，促进研究。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种。该方法不需要克隆目的基因，同源臂直接设计在PCR引物上，简单、快捷，且能进行多次基因操作，具有广泛的应用前景。为解决上述技术问题，本专利技术的，包括以下步骤I) PCR扩增抗性基因片段，其中在引物上添加目的重组基因的同源序列，具体如下以携带第一抗性基因(抗性标记)的质粒为模板，进行PCR扩增，获得第一抗性基因片段；其中，PCR扩增引物的5’端设计成与需要进行重组的基因序列同源的序列，同源序列长度在39-50碱基范围，PCR扩增引物的3’端设计成与需要扩增的抗性基因两侧同源的序列，使扩增获得的线性DNA中间为第一抗性基因，第一抗性基因的两侧连接有用于进行基因重组的短的同源序列；所述扩增抗性基因的引物设计方法以及携带抗性基因的质粒特征见[GustB., et al. , PCR-targeting system in streptomyces coelicolor A3(2). John InnesCentre:Norwich, 2002]详细描述。2)将扩增的第一抗性基因片段与克隆质粒连接后，将连接产物转化至大肠杆菌中，经筛选，得到阳性克隆质粒；3) PCR制备用于基因重组的DNA片段以步骤2)的克隆质粒上的克隆位点上下游序列作为保护序列，设计PCR扩增引物，并以步骤2)得到的阳性克隆质粒为模板，进行PCR扩增，得到用于敲除目的基因的同源重组DNA片段；本步骤中，通过设计引物、PCR扩增包含抗性基因、短同源臂以及相邻的上下游序列；其中，该同源重组DNA片段(线性DNA片段)中间为第一抗性基因，第一抗性基因两侧是短同源臂，短同源臂两侧是来源于克隆质粒上的序列，即第一抗性基因的两侧连接有用于基因敲除的短同源臂，短同源臂外侧连接有来自克隆质粒的序列作为保护序列；该短同源臂由步骤I)中的设计于引物上的短的同源序列形成。4)将步骤3)获得的同源重组DNA片段，电击转化至含有pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞内；5)将步骤4)的转化后的克雷伯氏肺炎杆菌细胞进行培养，筛选获得阳性重组子，从而获得基因重组的克雷伯氏肺炎杆菌细胞。所述，还可包括6)步骤5)获得的基因重组的克雷伯氏肺炎杆菌细胞(重组子)，通过利用携带第N抗性基因的质粒，可以重新按照步骤I) 5)进行操作，制备同时携带第N抗性基因(其他抗性标记)的同源重组DNA片段，以进行第二次或多于两次的基因重组操作。其中，携带第·N抗性基因的质粒中，N是大于或等于2的整数，且第N抗性基因不同于第一抗性基因；该携带第N抗性基因的质粒包括携带氯霉素抗性的质粒、携带四环素抗性的质粒、携带链霉素抗性的质粒或携带安普霉素抗性的质粒；即第N抗性基因包括氯霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因或安普霉素抗性基因。另外，本专利技术中，当需要重组后将抗性基因消除时，可在步骤I)中加入如下步骤在抗性基因(抗性标记)的两端添加 FRT 序列 gaagttcctatactttcta gagaataggaacttc (如 SEQ ID NO. I 所不)。所述步骤I)中，携带第一抗性基因的质粒包括携带安谱霉素抗性的质粒(如携带安谱霉素抗性的PU773质粒)，携带链霉素(壮观霉素)抗性的质粒，携带四环素抗性的质粒，或携带氯霉素抗性的质粒。步骤I)中，短的同源序列是指可以设计在PCR引物上的、与需要进行重组的目的基因同源的序列，长度在39到50碱基。所述步骤3)中，保护序列可以是任意的DNA序列，如长度为200-2000碱基对的保护序列，其中优选长度为400-700碱基对的保护序列。所述步骤5)中的阳性重组子，能通过卡那霉素筛选质粒pDK6-red丢失的克雷伯氏肺炎杆菌的菌株，然后，转进pDK6-flp质粒来消除插入染色体的两端连接有FRT序列的抗性基因，获得消除抗性标记的菌株。其中，该消除抗性标记的菌株，再通过卡那霉素筛选丢失质粒pDK6-flp的菌株后,再转进质粒pDK6-red后,可以按照上述步骤1)_6)重新进行基因同源重组操作。上述pDK6_red质粒和pDK6_flp质粒是携带卡那霉素抗性基因的质粒，受乳糖操纵子调控，分别表达Red重组酶和Flp重组酶，见详细描述。本专利技术通过两轮PCR和一步克隆制备用于克雷伯氏肺炎杆菌同源重组的DNA片段，该片段携带短的同源臂，短同源臂外侧添加保护序列的。短同源臂是直接设计到PCR引物上，通过引物合成而不用通过基因克隆获得。将制备的线性DNA片段转进携带pDK6-red质粒本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）以携带第一抗性基因的质粒为模板，进行PCR扩增，获得第一抗性基因片段；其中，PCR扩增引物的5’端设计成与需要进行重组的基因序列同源的序列，PCR扩增引物的3’端设计成与需要扩增的抗性基因两侧同源的序列，使扩增获得的DNA中间为第一抗性基因，第一抗性基因的两侧连接有用于进行基因重组的短的同源序列；2）将扩增的第一抗性基因片段与克隆质粒连接后，将连接产物转化至大肠杆菌中，经筛选，得到阳性克隆质粒；3）以步骤2）的克隆质粒上的克隆位点上下游序列作为保护序列，设计PCR扩增引物，并以步骤2）得到的阳性克隆质粒为模板，进行PCR扩增，得到用于敲除目的基因的同源重组DNA片段，该同源重组DNA片段中间为抗性基因，抗性基因两侧是短同源臂，短同源臂两侧是来源于克隆质粒上的序列；4）将步骤3）获得的同源重组DNA片段，电击转化至含有pDK6?red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞内；5）将步骤4）的转化后的克雷伯氏肺炎杆菌细胞进行培养，抗性筛选获得阳性重组子，从而获得基因重组的克雷伯氏肺炎杆菌细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郝健，魏东，柳鹏福，史吉平，姜标，
申请(专利权)人：上海中科高等研究院，
类型：发明
国别省市：
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