用于快速检测嗜肺军团菌的组合物和方法技术

本申请描述了可用于快速检测嗜肺军团菌(Legionella?pneumophila)的组合物和方法。所述组合物包括捕获探针、扩增引物、引物组以及检测探针，所述检测探针包含与嗜肺军团菌23SrRNA或编码23S?rRNA的DNA靶序列杂交的核酸分子。还描述了使用实时PCT?rPCR或逆转录实时PCR(RT-rPCR)检测和/或定量样品中嗜肺军团菌的量的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】领域本申请涉及用于检测嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的组合物和方法,并且更具体地涉及用于检测嗜肺军团菌23S rRNA靶序列的组合物和方法。背景嗜肺军团菌在人类中引起军团菌病和庞蒂亚克热。性质上它可以是社区获得性的或医院的，以及偶发性的或流行性的。其死亡率在无免疫应答的患者中可接近50%。已知军团菌属细菌也存留在诸如蓄水池的潮湿环境中，潮湿环境有利于通过诸如冷却塔或饮用水分配系统的感染源传播疾病。已描述了一些检测军团菌属细菌的方法。识别水样中嗜肺军团菌的“金标准”程序是分离培养。使用专门的缓冲炭酵母提取物(BCYE)培养基培养细菌是灵敏的和准 确的，但需要大约两周以最大限度的恢复，然后用菌落形态、革兰氏染色和血清学检测相结合鉴定细菌。为了克服这些限制，已经开发了利用PCR的免疫荧光方法和分子学方法。基于PCR的方法主要靶向嗜肺军团菌的5S、16S和23S rRNA基因，以及巨卩遼细胞感染性增强蛋白(macrophage infectivity potentiator,mip)基因。已描述了实时PCR方法用于快速检测军团菌。虽然靶向嗜肺军团菌mip基因的DNA的市售实时PCR试剂盒可得到，但是基于军团菌DNA检测的测定可能导致假阳性，因为在一定条件下细菌死亡后DNA不会像RNA —样很快降解。因此，需要用于检测嗜肺军团菌的新的组合物和方法。专利技术概述本公开内容提供可用于检测样品中嗜肺军团菌且靶向23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的组合物以及方法。本公开内容提供可用于分离嗜肺军团菌核酸的捕获探针，以及可用于扩增靶序列的PCR引物，以及选择性结合靶序列并促进检测靶序列的检测探针。还提供了使用实时聚合酶链反应(rPCR)或逆转录酶实时聚合酶链反应(RT-rPCR)检测嗜肺军团菌的方法。任选地，使用实时PCR定量样品中嗜肺军团菌的量。本文所公开的核酸分子和方法对嗜肺军团菌的23S rRNA或编码23SrRNA的DNA有选择性。如实施例2中所示，扩增引物和检测探针对非军团菌的微生物以及对非嗜肺军团菌的物种具有选择性。此外，如实施例3中所示，利用靶向23S rRNA的引物和检测探针，RT-rPCR容易地扩增了有相似灵敏度的所有15个嗜肺军团菌血清群。本文所述的检测方法比通常需要两周培育并识别军团菌的“金标准”培养方法明显更快。此外，本专利技术方法一般比依赖于免疫荧光或放射免疫测定的方法更为准确和灵敏。因此，在一个实施方案中，提供分离的核酸分子，其包含与SEQ IDNO :1-15中任何一个具有至少85%同一'丨生的序列或其互补物(complement)。在一个实施方案中，所述核酸分子包含与SEQ ID NO :1-15中任何一个具有至少90%、95%或99%同一性的序列或其互补物。在一个实施方案中，所述核酸分子与嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA的DNA杂父。在另一个实施方案中，提供包含核酸分子和亲和标记的捕获探针，所述核酸分子包含与SEQ ID NO 1-6中任何一个具有至少85%同一性的序列或其互补物。任选地，所述核酸分子包含与SEQ ID NO :1-6中任何一个具有至少90%、95%或99%同一性的序列。在一个实施方案中，所述亲和标记是生物素。任选地，所述亲和标记缀合到所述核酸分子的5’ 端。在一个实施方案中，所述亲和标记通过间隔分子(例如核酸)缀合到所述核酸分子。在一个实施方案中，提供适于扩增嗜肺军团菌23S rRNA或编码23SrRNA的DNA的引物，所述引物包含选自SEQ ID N0:l、7、12和13的某一序列。还提供了包含正向引物和反向引物的引物组，所述引物组适于扩增23S rRNA或编码23S rRNA的DNA靶序列。在一个实施方案中，所述引物组包括包含与SEQ ID NO :1具有至少85%同一性的第一引物，以及包含与SEQ ID NO :7具有至少85%同一性的第二引物。在另一个实施方案中，所述引物组包括包含与SEQ ID NO :12具有至少85%同一性的第一引物，以及包含与SEQ ID NO: 13具有至少85%同一性的第二引物。另一个实施方案包含使用本文所述的引物组，通过PCR扩增嗜肺军团菌23S rRNA 或编码23S rRNA的DNA而产生的分离的核酸分子。在一个实施方案中，第一和第二引物具有SEQ ID NO :1和7的序列，而且通过PCR扩增而产生的所述分离的核酸分子包含SEQ ID N0:17的序列。在另一个实施方案中，第一和第二引物具有SEQ ID NO :12和13的序列，而且通过PCR扩增而产生的所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO: 16的序列。在一个实施方案中，提供检测探针，其包括a)核酸分子，其包含与SEQ ID NO :8、9、10、11、14和15中任何一个具有至少85%同一性的序列或其互补物，和b)可检测的标记。在一些实施方案中，所述检测探针与包含23S rRNA或编码23S rRNA的DNA的靶序列杂交。在一个实施方案中，检测探针与通过用本文所述引物组之一的PCR扩增而产生的核酸分子杂交。所述可检测的标记可以是荧光团或产生可检测信号的其他标记。在一个实施方案中，检测探针包含通过荧光共振能量转移(FRET)或接触猝灭而与荧光团相互作用的猝灭剂。任选地，荧光团连接到所述核酸分子的5’端，而猝灭剂连接到所述核酸分子的3’ 端，所述检测探针适用于实时PCR。本公开内容还提供了可用于检测嗜肺军团菌的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含本文所述引物组的至少一个。在一个实施方案中，所述试剂盒包含检测嗜肺军团菌的说明书。任选地，所述试剂盒包含本文所述的一个或多个检测探针或捕获探针。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于检测样品中嗜肺军团菌的存在情况的方法，其包括a)提供疑似含有靶核酸的样品，所述靶核酸含有嗜肺军团菌23S rRNA或编码23S rRNA 的 DNA ；b)将所述样品与引物组接触，所述引物组包括i)包含与SEQ ID NO :1具有至少85%同一性的第一引物，以及包含与SEQ ID NO: 7具有至少85%同一性的第二引物，或ii)包含与SEQ ID NO :12具有至少85%同一性的第一引物，以及包含与SEQ ID NO :13具有至少85%同一性的第二引物；c)用所述第一引物和第二引物扩增所述靶核酸以产生靶核酸扩增产物；和d)检测靶核酸扩增产物的存在情况，其中所述靶核酸扩增产物的存在情况表示样品中嗜肺军团菌的存在情况。在一个实施方案中，使用聚合酶链反应(PCR)扩增所述靶核酸。在一个实施方案中，所述方法还包括用逆转录酶接触所述样品以产生编码23SrRNA的DNA。在一个实施方案中，编码23S rRNA的DNA是cDNA。在一个实施方案中，引物用于引导23S rRNA的逆转录， 所述引物包括选自SEQ ID N0:l、13、7和12的序列。在一个实施方案中，本文所述的方法使用实时PCR。例如，在一个实施方案中，使用实时PCR检测靶核酸产物的存在情况。任选地，同时用所述靶的扩增来检测靶核酸产物。在一些实施方案中，通过用本文所述的一个或多个检测探针接触靶核酸扩增产物而检测靶核酸扩增产物的存本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：J·罗，蔡宏，陈静，
申请(专利权)人：通用电气公司，
类型：
国别省市：