鉴定在人类血清中存在的蛋白质的方法，所述蛋白质在正常个体和按照医生诊断已知患有非小细胞肺癌和哮喘的患者之间差异地表达。将来自各个群体的人类血清试样用胰蛋白酶或任何其它合适的内切蛋白酶消化，并且使用液相色谱电喷雾离子化质谱仪进行分析。比较来自各个群体的质谱数据以确定具有在正常、哮喘和肺癌群体之间显著差异地表达的表达强度的蛋白质。发现１１种蛋白质具有在所述群体之间显著差异地表达的表达强度。最后，通过将所述质谱数据与具有已知蛋白质的质谱数据文库的已知数据库比较，获得１１种蛋白质的特征。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术主要涉及对人类肺组织的病理学状态(pathology)的诊断。更具体地，本 专利技术涉及使用液相色谱-质谱以鉴定在人类血清中存在的蛋白质来诊断非小细胞肺癌和 哮喘，当与正常群体中发现的相同蛋白相比在人类血清中在表达的相对强度方面改变时， 所述蛋白质指示与人类肺组织和人类呼吸系统相关的病理学状态。通过鉴定与此类病理学 状态相关的蛋白质，确定代表性的表达强度，并且将这些表达强度与在患者的血清中呈现 的表达强度比较，可以通过简单的血液测试在其发展早期检测病理学状态的存在并且区分 所述病理学状态。2.相关技术的描述呼吸系统的病理学状态，例如哮喘和肺癌，影响数以百万计的美国人。实际上，美 国肺科协会(American Lung Association)报道几乎2千万的美国人遭受哮喘痛苦。美国 癌症协会(American Cancer Society)估计仅在2007年就有229，400例呼吸系统的新的 癌症病例，164，840例死于呼吸系统的癌症。因此，当检测出癌症尽管仍然为局部时，癌症病 例的五年存活率为46%，肺癌患者的五年存活率仅为13%。相应地，在肺癌已经扩散前仅 16%的该疾病被发现。基于癌细胞的病理学状态通常将肺癌分类为两种主要类型。各类型 以被转化从而变得癌化的细胞的类型而命名。小细胞肺癌源自在人类肺组织中的小细胞， 而非小细胞肺癌通常包括不是小细胞类型的所有肺癌。因为对于所有的非小细胞类型治疗 通常相同，所以将非小细胞肺癌归类在一起。非小细胞肺癌或NSCLC—起占所有肺癌的约 75%。降低肺癌患者的存活率的主要因素为肺癌难以早期诊断的事实。在人类中诊断肺 癌或鉴定其存在的当前方法局限于采用X-射线、CT扫描和肺的类似扫描以物理上地确定 肿瘤的存在或不存在。因此，肺癌的诊断常常仅应答于已经呈现一段显著时间的症状，并 且在所述疾病已经在人类中呈现足够长的时间以产生物理上可检测的团块(mass)之后进 行。类似地，检测哮喘的当前方法典型地在症状例如反复哮喘、咳嗽和胸闷呈现后长 时间进行。检测哮喘的当前方法典型地局限于肺功能测试例如肺活量测试或激发测试 (challenge test)。此外，这些测试被医生命令与许多其它测试一起进行以排除其它病理 学状态或疾病例如慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管炎、肺炎和充血性心力衰竭。在现有技术中没有在其发展早期诊断人类肺组织的病理学状态的简单可靠的方 法。此外，现在不存在能够指示特定肺组织病理学状态的存在的可利用的血液测试。因此期望开发在疾病发展早期确定肺癌的存在的方法。同样地期望开发在症状的出现的最早期 诊断哮喘和非小细胞肺癌和使其相互区分开和与其它肺疾病例如感染区分开的方法。进一 步期望鉴定在人类血液中存在的特定蛋白质，其当在表达的相对强度方面改变时，指示非 小细胞肺癌和/或哮喘的存在。专利技术概述本专利技术提供使用液相色谱电喷雾离子化质谱(“LC-ESIMS”)，鉴定在人类血清中存 在的蛋白质的新方法，所述蛋白质在正常个体和按照医生诊断而已知患有非小细胞肺癌和 哮喘的患者之间差异地表达。指示非小细胞肺癌和/或哮喘的蛋白质的选择通过将质谱数 据，即肽的质量和在一维上随时间表达的蛋白质强度的图解表示(graphicalindications) 比较来进行。比较了数以千计的蛋白质，导致11种蛋白质的选择，所述蛋白质在不患有任 何肺组织病理学状态的个体的群体、按照医生诊断患有哮喘的个体的群体和按照医生诊断 患有非小细胞肺癌的个体的群体之间以基本上不同的强度表达。具体地，人类血清从“正常群体”、“哮喘群体”和“肺癌群体”获得。本文所用的“正 常群体”旨在定义已知未患有哮喘或肺癌的那些个体。本文所用的“哮喘群体”旨在定义已 知患有哮喘并且被医生诊断患有哮喘的那些个体。本文所用的“肺癌群体”旨在定义已知 患有非小细胞肺癌并且被医生诊断患有非小细胞肺癌的那些个体。获得正常群体、哮喘群体和肺癌群体的血清之后，将各血清试样分成等分试样并 且暴露于消化剂(digesting agent)或蛋白酶，即，胰蛋白酶，以将在血清试样中存在的蛋 白质消化成定义的和可预测的裂解物(cleavages)或肽。通过胰蛋白酶的酶促作用形成 的肽，通常称为胰蛋白酶肽，然后通过将所述试样进行离心以使不溶物质沉淀而从不溶物 质分离。包含胰蛋白酶肽的上清液然后进行毛细液相色谱以实现胰蛋白酶肽的时空分离 (tempero-spatial separation)0所述胰蛋白酶肽然后进行LC-ESIMS。各肽通过使所述肽通过疏水性流体的柱来及 时地分离，即，使水、包含0. 体积甲酸的乙腈通过包含Supelcosil ΑΒΖ+5 μ m填充材料 固定相的色谱柱，床长18cm，内径0.375mm。分离的肽通过柱洗脱液加载。所述柱具有这样 的终点，从该终点分离的肽然后通过施加高电压至相对于地面具有正偏压的柱尖，形成带 电荷的小滴而电喷雾化，所述带电荷的小滴通过施加的电场的力向LC-ESIMS的入口加速。 形成的所得喷雾由包含溶解的胰蛋白酶肽的溶剂的小滴组成。所述小滴通过经过电喷雾源 的大气压区域然后进入加热的LC-ESIMS的毛细管入口来去溶剂化。所述小滴的去溶剂化导致带正电的离子(最典型地为氢)(H+)沉积在所述肽上，给予所述肽以电荷。在气相中此类带电荷的肽在本领域描述为“假分子离子 (pseudo-molecular ions) ”。所述假分子离子通过各种电势被拉入LC-ESIMS的质谱仪，其 中它们在空间和时间上基于质荷比分离。一旦通过质荷比分离，所述假分子离子然后通过 另外的电场梯度导向LC-ESIMS的检测器，其中所述假分子离子束转化成通过数据记录设 备记录的电脉冲。这样，使在胰蛋白酶消化物中存在的肽传递到在LC-ESIMS中的质谱仪，其中对各 肽测定分子量，在来自样品的肽从所述柱离开(passout)的整个时间范围产生重复获得的 时间增量质谱。质谱读数通常为通过LC-ESIMS发现的肽的图解说明，其中χ轴为测定的质 荷比，y轴为所述肽的信号强度。这些质谱然后可以及时地组合成三维显示，其中χ轴为色谱分离的时间，Z轴为质谱的质量轴，和1轴为质谱信号的强度，其与通过LC-ESIMS检测的 给定假分子离子的量成比例。接下来，进行比较分析，对于从哮喘群体和肺癌群体测试的各个试样和从正常群 体测试的各个试样比较质谱读数。在哮喘、肺癌和正常病理学状态方面将与在LC-ESIMS中 检测出的推定鉴定的蛋白相关的各胰蛋白酶肽假分子离子信号(“峰”)比较。将具有如下 质谱峰强度的肽确定为无意义的并且排除其指示当将哮喘群体或肺癌群体与正常群体比 较时肽的量未基本上改变。通常，所用的排除标准包括将给定蛋白质的至少一半鉴定的特 征肽的肽峰强度在源自来自各病理学状态的个体患者血清的分析的至少10个数据组方面 做比较。如果源自给定蛋白质的大多数肽峰的强度在强度上是80%的血清数据组至少10 倍，将所述蛋白质分类为在两种病理学状态类别之间差异地调节。 作为比较分析的结果，11种蛋白质确定为在哮喘群体，肺癌群体和正常群体之间 一致地差异地表达。该11种蛋白质通过参考蛋白质和肽的已知数据库或文库来鉴定。此 类数据库的实例包括本文档来自技高网...
【技术保护点】
鉴定在人类血清中存在的指示人类肺组织的病理学状态的蛋白质的方法，当与来自未患有所述病理学状态的人类的血清中相同的所述蛋白质的表达水平相比时，所述蛋白质具有改变的表达水平，所述方法包括以下步骤：第一获得步骤，从不患有所述人类肺组织的所述病理学状态的人类群体获得大量人类血清；第二获得步骤，从患有哮喘的人类群体获得大量人类血清；第三获得步骤，从患有非小细胞肺癌的人类群体获得大量人类血清；暴露步骤，将在所述第一获得步骤、所述第二获得步骤和所述第三获得步骤中获得的所述人类血清暴露于消化剂，所述消化剂将在所述人类血清中的所述蛋白质裂解成可预测和定义的肽；分离步骤，从所述人类血清分离所述肽；使用液相色谱质谱仪，将来自在所述第一获得步骤、所述第二获得步骤和所述第三获得步骤中获得的各个所述大量人类血清的所述肽进行分析，所述质谱仪其中具有疏水性固定相的柱，以及流过所述柱的溶剂系统，所述溶剂系统分离所述肽，以及检测机构以产生质谱读数，所述质谱读数包括所述肽的质量和测量随着所述肽通过所述柱的时间阶段的所述肽的所述强度的图解说明；第一比较步骤，将来自在所述第一获得步骤中获得的所述人类血清的所述质谱读数与来自在所述第二获得步骤中获得的所述人类血清的所述质谱读数进行比较；第二比较步骤，将来自在所述第一获得步骤中获得的所述人类血清的所述质谱读数与来自在所述第三获得步骤中获得的所述人类血清的所述质谱读数进行比较；第三比较步骤，将来自在所述第二获得步骤中获得的所述人类血清的所述质谱读数与来自在所述第三获得步骤中获得的所述人类血清的所述质谱读数进行比较；选择步骤，选择在所述第一比较步骤、所述第二比较步骤和所述第三比较步骤中比较的所述质谱读数，其中所述质谱读数指示在以下之间相同的所述肽的基本上变化的所述强度：（ａ）．患有所述哮喘的所述人类群体与不患有所述肺组织病的所述病理学状态的所述人类群体；（ｂ）．患有所述非小细胞肺癌的所述人类群体与不患有所述肺组织病的所述病理学状态的所述人类群体；和（ｃ）．患有所述哮喘的所述人类群体与患有所述非小细胞肺癌的所述人类的所述群体；鉴定步骤，通过从在所述选择步骤期间选择的所述质谱读数获得所述肽的特征，鉴定指示所述人类肺组织的所述病理学状态的所述蛋白质；和其中所述人类肺组织的所述病理学状态包括所述哮喘和所述非小细胞肺癌。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：RT斯特里佩，E伊兹比卡，SH贝克，
申请(专利权)人：癌症预防和治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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