嗜肺军团菌生化反应的鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种嗜肺军团菌生化反应的鉴定方法，包括马尿酸盐水解试验、硝酸盐还原试验、尿素酶试验及明胶液化试验等四步试验鉴定，技术关键是在生化反应的马尿酸盐水解试验、硝酸盐还原试验、尿素酶试验、明胶液化试验的培养基中分别加入Ｌ－半胱氨酸。本发明专利技术可应用于疾病预防控制系统、出入境检疫局、技术监督部门、环境保护、医院等行业中的环境水、空调冷却水、冷凝水、痰、气管抽吸液、肺组织等中嗜肺军团菌的鉴定，且工艺简单，方便易行，检测速度快、效率高，为嗜肺军团菌的快速检测鉴定提供了一套新的科学方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及嗜肺军团菌生化反应，尤其是一种嗜肺 军团菌生化反应的鉴定方法。技术背景微生物的生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，常用来鉴 别一些在形态和其它方面不易区别的微生物，是微生物分类鉴定中的重要依 据之一。不同种类的细菌，由于其细胞内新陈代谢的酶系不同，对营养物质的 吸收利用、分解、排泄及合成产物的产生等都有很大的差别，细菌的生化试验 就是检测某种细菌能否利用某种(些)物质极其对某种(些)物质的代谢及合成 产物，以确定细菌合成和分解代谢产物的特意性,借此来鉴定细菌的种类；或 者通过在培养基的成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的物 质，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便地确定目的菌。嗜肺军团菌的检测 是评价公共场所集中空调通风系统是否污染以及诊断是否由嗜肺军团菌感染 引起的肺炎的重要指标，其检测鉴定技术的研究是目前国内外生物学领域研 究的热点之一。嗜肺军团菌鉴定的常用方法是通过菌落形态、革兰氏染色、在不同的培 养基上生长的特性、生化反应、血清学鉴定、PCR方法的确认来鉴定。目前 国内用的较多的鉴定方法是利用此菌在不同培养基上生长的特性，根据菌落 形态、革兰氏染色、在不同的培养基上生长的特性、血清学鉴定、PCR方法， 而通过生化反应做的鉴定不多，其原因是现有的生化反应难以确认，国内目前 还没有专门用于鉴定嗜肺军团菌生化反应特异性培养基的商品。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种工艺方法简单、鉴 定快速方便的一种。 本专利技术采取的技术方案是一种，包括马尿酸盐水解试验、硝酸盐 还原试验、尿素酶试验及明胶液化试验四步试验鉴定，其特征在于(1).马尿酸盐水解试验将待试菌纯培养物接种于马尿酸盐培养基中，加1 3滴L一半胱氨酸液充分混匀使体系浓度为0.4^L，在37。C温度条件下培 养24h，加入茚三酮试剂0.2ml，继续培养10min，根据上层液呈现红色或紫红色即可鉴定嗜肺军团菌为阳性，无色改变为阴性；(2) .硝酸盐还原试验调取待试菌培养物，接种于硝酸盐培养基中，加l 3滴L一半胱氨酸液充分混匀使体系含量为0.4g/L，在37"C温度条件下培养 24h 48h，形成液体培养物，然后将混合试剂O.lml加于液体培养物，根据 立即或于10min内呈现红色即可鉴定试验为阳性，无红色出现则为阴性；(3) .尿素酶试验取待试菌培养物接种于尿素酶培养基中，加1 3滴L 一半胱氨酸液充分混匀使体系含量为0.4g/L，在37。C温度条件下培养24h; 变为粉红色即可鉴定为阳性，无变化为阴性；(4) .明胶液化试验在明胶培养基中加1 3滴L—半胱氨酸液充分混匀 使体系浓度为0.4g/L，分装于试管内，经115。C灭菌20min灭菌后，直立成 高层；然后取待试菌培养物，穿刺接种在明胶培养基内，在37'C温度条件下 培养24h，取出放冰箱10min 30min;如仍呈溶解状时即可鉴定嗜肺军团菌 为阳性，凝固不溶者为阴性。而且，上述茚三酮试剂的制备方法是将茚三酮溶于l: l等量混合的丙酮和丁醇中即可。而且，硝酸盐还原试验中所述的混合试剂由A试剂和B试剂等量混合形 成，其中A试剂由磺胺酸、冰醋酸及蒸馏水混合构成，B试剂由a—萘酚及 无水乙醇混合构成。本专利技术的优点和积极效果是1. 本专利技术应用至今已成功地检出多例嗜肺军团菌，经阴性和阳性对照效 果非常显著,为嗜肺军团菌检测鉴定提供了重要的技术支撑和保障。2. 本专利技术可应用于疾病预防控制系统、出入境检疫局、技术监督部门、 环境保护、医院等行业中的环境水、空调冷却水、冷凝水、痰、气管抽吸液、 肺组织等中嗜肺军团菌的鉴定，是对各种嗜肺军团菌污染检测鉴定的重要工 具之一。3. 本专利技术工艺简单，方便易行，检测速度快、效率高，为嗜肺军团菌的 检测鉴定提供了一套新的科学方法。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的
技术实现思路
做进一步说明；下述实施例是说明 性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。本专利技术所涉及的嗜肺军团菌生化反应主要包括马尿酸盐(Hipprate)水解 试验、硝酸盐还原试验、尿素酶试验及明胶液化试验。下面具体叙述试验鉴 定方法。一、马尿酸盐(Hipprate)水解试验 1. 马尿酸盐培养基的制备牛肉浸汤 100.0ml 马尿酸钠(Sod. Hipprate) l.Og将上述二种物质混合溶解溶解，即制成马尿酸盐培养基。2. 茚三酮(Ninbyolrin)试剂制备将3.5g茚三酮溶于100mL的丙酮和丁醇(为1: 1等量混合液)即制成 茚三酮试剂。3. 嗜肺军团菌马尿酸盐水解试验将待试菌纯培养物接种于马尿酸盐培养基中，加1 3滴L一半胱氨酸液 充分混匀使体系浓度为0.4g/L，在37。C温度条件下培养24h，加入茚三酮试 剂0.2ml，继续培养10min。4. 鉴定上层液呈现红色或紫红色为阳性，无颜色改变为阴性。 二、硝酸盐(Nitrate)还原试验1. 硝酸盐培养基制备 牛肉浸膏 3.0g 蛋白胨 5.0g 硝酸钾 l.Og将上述各成分溶于1L的蒸馏水中,调至PH7.0，分装试管，每管约5ml， 于12rC灭菌15 min，即制成硝酸盐培养基。2. 试剂制备 A试剂磺胺酸(Sulfanilic Acid) 0.5g 冰醋酸 30.0ml 蒸馏水 120.0ml B试剂a—萘酚(Alpha-naphthol) 0.5g无水乙醇 200.0ml 。3 .硝酸盐(Nitrate)还原试验调取待试菌培养物，接种于硝酸盐培养基中，加1 3滴L—半胱氨酸液 充分混匀使体系含量为0.4g/L，在37"C温度条件下培养24h 48h，形成液体 培养物；然后将A试剂和B试剂各0.2ml等量混合形成混合试剂，取混合试 剂约0.1ml加于液体培养物。 4.鉴定立即或于10min内呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为 阴性。进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。除不接种菌外， 均与试验管同样处理。三、尿素酶(Urease)试验l.尿素酶培养基的制备酵母浸膏 O.lg磷酸二氢钾 0.091g磷酸氢二钠 0.095g尿素 20.0g酚红 O.Olg除酚红和尿素外，将上述各成分加热溶化于900.0ml蒸馏水中，调至 PH6.9,加入酚红指示剂，混匀，于12rC温度条件下灭菌15min;然后冷至 约55"C，加入过滤除菌的20%尿素水溶液100ml，混匀，以无菌操作分装灭 菌试管，每管约3 4ml，放冰箱备用。2. 尿素酶试验取待试菌培养物接种于尿素酶培养基中，加1 3滴L—半胱氨酸液充分 混匀使体系含量为0.4g/L，在37"温度条件下培养24h。3. 鉴定变为粉红色为阳性，无变化为阴性。 四、明胶(Gelatin)液化试验1. 明胶培养基牛肉膏 3.0g 蛋白胨 5.0g 明胶 120.0g取各成分加到1000.0ml蒸馏水中浸泡20 min，随时搅拌加温使之溶解， 调PH至7.4，加1 3滴L一半胱氨酸液充分混匀使体系浓度为0.4g/L，分 装于试管内，经115"灭菌20min灭菌后，直立成高层备用。2. 尿素酶试验法取待试菌培养物，穿刺接种在明胶培养基内，在37'C温度条件下培养 24h，取出放冰箱10mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嗜肺军团菌生化反应的鉴定方法，包括马尿酸盐水解试验、硝酸盐还原试验、尿素酶试验及明胶液化试验四步试验鉴定，其特征在于：（１）．马尿酸盐水解试验：将待试菌纯培养物接种于马尿酸盐培养基中，加１～３滴Ｌ－半胱氨酸液充分混匀使体系浓度为０．４ｇ／Ｌ，在３７℃温度条件下培养２４ｈ，加入茚三酮试剂０．２ｍｌ，继续培养１０ｍｉｎ，根据上层液呈现红色或紫红色即可鉴定嗜肺军团菌为阳性，无色改变为阴性；（２）．硝酸盐还原试验：调取待试菌培养物，接种于硝酸盐培养基中，加１～３滴Ｌ－半胱氨酸液充分混匀使体系含量为０．４ｇ／Ｌ，在３７℃温度条件下培养２４ｈ～４８ｈ，形成液体培养物，然后将混合试剂０．１ｍｌ加于液体培养物，根据立即或于１０ｍｉｎ内呈现红色即可鉴定试验为阳性，无红色出现则为阴性；（３）．尿素酶试验：取待试菌培养物接种于尿素酶培养基中，加１～３滴Ｌ－半胱氨酸液充分混匀使体系含量为０．４ｇ／Ｌ，在３７℃温度条件下培养２４ｈ；变为粉红色即可鉴定为阳性，无变化为阴性；（４）．明胶液化试验：在明胶培养基中加１～３滴Ｌ－半胱氨酸液充分混匀使体系浓度为０．４ｇ／Ｌ，分装于试管内，经１１５℃灭菌２０ｍｉｎ灭菌后，直立成高层；然后取待试菌培养物，穿刺接种在明胶培养基内，在３７℃温度条件下培养２４ｈ，取出放冰箱１０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ；如仍呈溶解状时即可鉴定嗜肺军团菌为阳性，凝固不溶者为阴性。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于凌琪，
申请(专利权)人：天津市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]