沙眼衣原体检测用引物和探针、以及使用该引物和探针的沙眼衣原体的检测方法技术

本发明专利技术涉及：基于序列号1或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体(Chlamydia?trachomatis)的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸，沙眼衣原体检测用寡核苷酸引物和探针，使用该引物和探针的沙眼衣原体的检测方法，以及该寡核苷酸在沙眼衣原体检测用引物或探针设计中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用了核酸的扩增及其检测系统的、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)的检测和/或鉴定方法。
技术介绍
目前，伴随性风俗的多样化、以年轻人为中心的日本人的性行为样式的变化，作为性感染症的衣原体感染症的增加显著。衣原体(Chlamydia)是真核细胞的专性细胞内寄生细菌。衣原体在宿主细胞内生·长繁殖，在细胞的细胞质中形成包涵体(inclusion)，成为宿主的临床症状的原因。例如，性器官衣原体感染症的病原菌是沙眼衣原体，主要在男性中引发尿道炎，在女性中引发宫颈炎。作为衣原体的检测法，开发了直接荧光抗体染色(DFA)、酶免疫测定法(EIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)等检测抗原的方法。另外，还开发了通过使用经标记物质标记的、与沙眼衣原体的核糖体RNA互补的单链DNA的探针杂交来检测沙眼衣原体的方法(Gen-Probe Pace 2 Chlamydia test、非专利文献 I)。另外，还开发了利用核酸扩增技术的、更高灵敏度的检测方法。例如，Domeika等(非专利文献2)、Bauwens等(非专利文献3)和美国专利第5，232，829号说明书(专利文献I)报告了进行聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction、PCR)和接下来的微量滴定板杂交来检测沙眼衣原体的方法。另外，还报告了进行连接酶链反应(Ligase Chain Reaction、LCR)和接下来的微粒夹心免疫测定检测来检测沙眼衣原体的方法(非专利文献4、非专利文献5、非专利文献6)。另外，已知沙眼衣原体在其菌内具有多拷贝的特异的内源性质粒(非专利文献7)。而且，还开发了以该内源性质粒的特定序列为靶，通过基因扩增法扩增其一部分序列，检测扩增产物，从而检测沙眼衣原体的方法(专利文献2、专利文献3)。但是，已知沙眼衣原体中存在免疫学上确定的18种血清型。而且，近年来报告了通过如上所述现有的沙眼衣原体的检测法不能检测沙眼衣原体的事例(非专利文献8)。即，判明了在现有的沙眼衣原体的检测法中有时会产生伪阴性的判定，成为问题。现有技术文献专利文献专利文献I:美国专利第5232829号说明书专利文献2:日本特许第2719225号公报专利文献3:日本特许第3127135号公报非专利文献非专利文献l:Warren R.，et al. , Journal of ClinicalMicrobiology, 1993, 31, 1663-1666.非专利文献2:Domeika M.et al. , Journal of ClinicalMicrobiology, 1994，32，2350-2352非专利文献3:Bauwens J. E. et al. , Journal of ClinicalMicrobiology, 1993，31，3013-3106非专利文献4:Chernesky Max A. et al. , Journal of ClinicalMicrobiology, 1994，32，2682-2685 非专利文献5: Lee H. H. et al.，Lancet, 1995，345，213-216非专利文献6:Bassiri M. et al.，J. Clin. Microbiol.，1995，33，898-900非专利 文献 7:C.Hatt et al. , Nucleic AcidsResearch, 1988, 16(9), p. 4053-4067非专利文献8:Emerging Infectious Diseases Vol. 14, No. 9, September 2008
技术实现思路
专利技术要解决的课题本专利技术是鉴于如上所述的状况而做出的，课题是提供不产生伪阴性的判定、灵敏度和特异性优异且迅速的沙眼衣原体的检测方法和在该方法中使用的引物和探针。用于解决课题的方法本专利技术是为了解决上述课题而做出的，包括以下的构成。(I)寡核苷酸，其基于序列号I或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交。(2)寡核苷酸引物，其基于序列号I或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交。(3)寡核苷酸探针，其基于序列号I或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交。(4)沙眼衣原体的检测方法，其特征在于，为了以序列号10所示的沙眼衣原体的内源性质粒基因中的、具有序列号I所不的喊基序列的喊基号4133 喊基号4277的区或具有序列号2所不的喊基序列的喊基号32 喊基号176的区、或这些区内进一步特定的区作为靶，确认试样中是否存在具有这些区的碱基序列的寡核苷酸，而使用基于序列号I或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸作为引物，以试样中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，检测该反应的结果所生成的产物。(5)沙眼衣原体检测用试剂盒，其中，包含基于序列号I或序列号2所示的碱基序列而设计、且与沙眼衣原体的内源性质粒基因杂交的寡核苷酸作为引物或/和探针。本专利技术者们对于到目前为止确定的沙眼衣原体和其他生物的各种基因反复进行了各种间的各基因序列的同源性的理论验证和实验验证。其结果是，得到了最适合沙眼衣原体的检测的核酸序列，并且进一步以这些序列为基础开发了沙眼衣原体检测用引物和探针，确立了使用这些引物和探针的沙眼衣原体的检测方法，从而完成了本专利技术。专利技术的效果根据本专利技术，可提供灵敏度和特异性优异且迅速的沙眼衣原体的检测方法。另外，通过使用本专利技术所提供的检测用引物的检测方法，可以避免现有方法中可能发生的伪阴性，精度良好地进行沙眼衣原体的检测。附图说明图I是实施例2所得的、使用引物TcTI_Fw01和引物TcTI_Rv01、使用来源于沙眼衣原体的DNA试样作为模板的实时PCR所得的扩增曲线。图2是以实施例2中进行的实时PCR所得的扩增曲线为基础制成的、将Ct值(y轴)相对于基因组的拷贝数(X轴、对数值)作图而得的标准曲线。图3是实施例3所得的、使用引物TcTI_Fw02m和引物TcTI_Rv02、使用来源于沙眼衣原体的DNA试样作为模板的实时PCR所得的扩增曲线。图4是以在实施例3中进行的实时PCR所得的扩增曲线为基础制成的、将Ct值(y轴)相对于基因组的拷贝数(X轴、对数值)作图而得的标准曲线。具体实施例方式本专利技术者们着眼于作为沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的内源性质粒的、被称为PLGV440的质粒。沙眼衣原体的内源性质粒(隐蔽性质粒，cryptic plasmid)pLGV440基因的全碱基序列记载于非专利文献7的图2，大小为7498碱基，在本说明书中为序列号10所示的碱基序列。在本专利技术中，记载为“沙眼衣原体的内源性质粒基因”的情况，有指上述的沙眼衣原体的内源性质粒(pLGV440)基因的全喊基序列的情况、和指该全喊基序列中的任意喊基序列单元(区)的情况。此外，以下有将“沙眼衣原体的内源性质粒”仅称为“内源性质粒”这样的情况。本专利技术者们注意到来自内源性质粒(pLGV440)基因的特别的2个区。即，序列号10所示的沙眼衣原体的内源性质粒(PLGV440)基因的、碱基号4133 碱基号4277的区(包含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：石川友一，公文裕巳，
申请(专利权)人：和光纯药工业株式会社，
类型：
国别省市：