一种军团菌抗原乳胶法检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及乳胶法免疫层析领域，具体公开了一种军团菌抗原乳胶法检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上，所述致敏乳胶聚酯膜上包被有彩色乳胶颗粒标记的抗军团菌单克隆抗体-1，免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗军团菌单克隆抗体-2的检测线和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。本发明专利技术的军团菌抗原乳胶法检测试剂盒反应灵敏，检测方便、检测结果稳定，节约成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫层析
，具体涉及一种军团菌抗原检测试剂盒及其制备与应用。
技术介绍
军团菌为需氧的多性革兰阴性菌，广泛存在于自然环境中，其传染源是水源和空调系统，通过空气传播。军团杆菌的菌体微小,悬浮在空气中,人在正常呼吸时,会将空气中含有军团杆菌的气溶胶吸入呼吸道内,致使军团杆菌有机会侵染肺泡组织和巨噬细胞,引发炎症,导致军团菌病，易爆发流行。军团杆菌可以侵犯身体内许多器官,因此其临床表现常是多种多样。军团菌病根据临床特征,一般分为两种类型,一类为非肺炎型,病情较轻,潜伏期1～2d,似普通感冒或流感样起病,有发热、肌痛、咽喉疼痛、咳嗽等症状,约1～2周可自愈。另一类是肺炎型,潜伏期2～10d,其初发症状为全身不适、疲乏、肌肉酸痛、头痛、发热、咳嗽、胸痛、咳血、呼吸困难等,还能侵犯消化系统、中枢神经系统,重症病人可出现肝功能变化及肾功能衰竭,并可出现精神紊乱等脏器损害。乳胶层析法是以彩色乳胶为标记物的免疫层析法，其检测原理与胶体金免疫层析法相类似，它不需要仪器，直接用肉眼判读结果，具有操作简单、快速，试剂稳定性好，易保存，单人份独立包装，试剂损耗少等优点，适合临床患者、健康体检者等标本的快速筛查。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术缺陷，从提高检测灵敏度出发，提供一种检测灵敏度高、特异性强、检测快速的军团菌抗原乳胶法检测试剂盒。本专利技术的第一方面公开了一种军团菌抗原乳胶法检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上，所述致敏乳胶聚酯膜上包被有彩色乳胶颗粒标记的抗军团菌单克隆抗体-1，免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗军团菌单克隆抗体-2的检测线和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。较优的，所述彩色乳胶颗粒为粒径290～300nm的聚苯乙烯颗粒。较优的，所述彩色乳胶颗粒的颜色为红色。本专利技术的另一方面，提供了一种军团菌抗原乳胶法检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：1)致敏乳胶颗粒的制备：用羧基化的聚苯乙烯标记抗军团菌单克隆抗体-1，获得致敏乳胶颗粒；2)致敏乳胶聚酯膜的制备：用步骤1)获得的致敏乳胶颗粒包被聚酯膜，获得致敏乳胶聚酯膜；3)将抗军团菌单克隆抗体-2和羊抗鼠IgG多克隆抗体分别喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)和质控线(C线)的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；4)将滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC片上，切裁制得试剂条；5)将试剂条装入塑料盒，获得军团菌抗原乳胶法检测试剂盒。较优的，所述步骤1)致敏乳胶颗粒的制备为：a.取一定体积的羧基化的聚苯乙烯，用2～3倍体积20mMpH6.0的碳酸缓冲溶液多次冲洗、离心、弃上清，获得羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀；b.用1～1.5倍体积20mMpH6.0的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀，并加入1～1.5倍体积的水溶性炭化二亚胺，室温下搅拌20～30分钟，最后用2～3倍体积0.01MpH8.0的硼酸缓冲溶液多次冲洗、离心、弃上清，获得待标记物；c.向步骤b获得的所述待标记物中加入2～3倍体积0.2MpH7.0的硼酸缓冲液制成乳胶悬液，并向所述乳胶悬液中加入抗军团菌单克隆抗体-1；d.充分反应过夜，加入终止剂终止反应，获得致敏乳胶颗粒。在致敏乳胶颗粒的制备过程中，加入的水溶性炭化二亚胺、各缓冲溶液的体积均以初始所取的羧基化的聚苯乙烯的体积为基准，按本专利技术所述的体积倍数加入：如所取的羧基化的聚苯乙烯颗粒的体积为1ml，则需要加入的pH6.020mM的磷酸缓冲溶液体积可以为1～1.5ml，pH7.00.2M的硼酸缓冲液的体积为2～3ml。更优的，所述步骤a中碳酸缓冲溶液为20mMpH6.0含0.01％SDS的碳酸缓冲溶液。添加有SDS的碳酸缓冲溶液可以更好的洗去乳胶的表面活性物，清洗效果更好。更优的，所述步骤a中羧基化的聚苯乙烯浓度为6～12w/v％。更优的，所述步骤a中的离心条件为12000～14000rpm，离心10min。更优的，所述步骤b中水溶性炭化二亚胺的浓度为9～10mg/ml。更优的，所述步骤b中的离心条件为12000～14000rpm，离心10min。更优的，所述步骤c乳胶悬液中羧基化的聚苯乙烯颗粒偶联抗军团菌单克隆抗体-1的量为：0.5mg抗军团菌单克隆抗体-1/10mg聚苯乙烯颗粒。更优的，所述步骤d中终止剂为50mMpH8.2的Tris-HCl。本专利技术中，v％指体积百分比；w/v％指重量体积百分比，如1w/v％即为100ml溶液中含1g物质。较优的，所述步骤2)中致敏乳胶聚酯膜的制备具体步骤为：A.用乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒，获得0.3～0.5w/v％的致敏乳胶溶液；B.用步骤A制备好的致敏乳胶溶液喷涂聚酯膜，干燥，制得致敏乳胶聚酯膜。更优的，所述步骤A中的乳胶缓冲液配方如下：9～11v％1.0MTris液，0.25～0.35w/v％聚乙二醇20000，0.18～0.20w/v％牛血清白蛋白，0.15～0.25w/v％脱脂牛奶，0.28～0.30w/v％酪蛋白，和0.04～0.06w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.0±0.02，余量为水。最优的，所述步骤A中的乳胶缓冲液配方如下：10v％1.0MTris液、0.3w/v％聚乙二醇20000、0.2w/v％牛血清白蛋白，0.2w/v％脱脂牛奶、0.3w/v％酪蛋白，和0.05w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.0±0.02，余量为水。进一步较优的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本专利技术所述的乳胶缓冲液还包括下列组分：果糖、氯化钾和甘氨酸，且果糖、氯化钾和甘氨酸的总浓度为3.25～4.75g/L，缓冲液的pH值为7.3－7.5。更优选的，各组分在乳胶缓冲液中的浓度为：果糖1.0-2.0g/L；氯化钾0.25-0.5g/L；甘氨酸2.0-2.25g/L。更优的，步骤B中用致敏乳胶溶液喷涂聚酯膜，每261mm×220mm聚酯膜上喷涂1.28ml致敏乳胶溶液，干燥，制得致敏乳胶聚酯膜。较优的，所述步骤3)中，喷在硝酸纤维素膜质控线(C线)上的羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1.0～2.0mg/ml，喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)上的抗军团菌单克隆抗体-2浓度为1.0～2.0mg/ml。较优的，每50m长硝酸纤维素膜分别包被有6ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体和6ml的抗军团菌单克隆抗体-2溶液，检测线和质控线的间距为4.0～6.0mm。本专利技术制备的军团菌抗原乳胶法检测试剂盒灵敏度高，特异性强此外本专利技术的试剂盒还具有操作简单，价格低，储存和运输方便等优点。本专利技术军团菌抗原检测试剂盒的使用方法：1.样品的检测：用吸管吸取样品液2-3滴加入到样品槽中，待检样品在毛细作用下向吸水纸端层析，依次通过聚酯膜、硝酸纤维素膜。到达聚酯膜后，被乳胶标记的抗体充分识别并结合，继续层析到硝酸纤维素膜上，与硝酸纤维素膜上包被的抗军团菌单克隆抗体-2发生免疫反应，显现出相应的红色线条。2.结果的判读：在滴加样品后8-15分钟判读结果。阳性：在检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种军团菌抗原检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上，其特征在于，所述致敏乳胶聚酯膜上包被有彩色乳胶颗粒标记的抗军团菌单克隆抗体‑1，免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗军团菌单克隆抗体‑2的检测线和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。

【技术特征摘要】
1.一种军团菌抗原检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上，其特征在于，所述致敏乳胶聚酯膜上包被有彩色乳胶颗粒标记的抗军团菌单克隆抗体-1，免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗军团菌单克隆抗体-2的检测线和包被了羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述彩色乳胶颗粒为粒径290～300nm的聚苯乙烯颗粒。3.权利要求1-2任一权利要求所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：1)致敏乳胶颗粒的制备：用羧基化的聚苯乙烯标记抗军团菌单克隆抗体-1，获得致敏乳胶颗粒；2)致敏乳胶聚酯膜的制备：用步骤1)获得的致敏乳胶颗粒包被聚酯膜，获得致敏乳胶聚酯膜；3)将抗军团菌单克隆抗体-2和羊抗鼠IgG多克隆抗体分别喷在硝酸纤维素膜检测线和质控线的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；4)将滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC片上，切裁制得试剂条；5)将试剂条装入塑料盒，获得军团菌抗原乳胶法检测试剂盒。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)致敏乳胶颗粒的制备为：a.取一定体积的羧基化的聚苯乙烯，用2～3倍体积20mMpH6.0的碳酸缓冲溶液多次冲洗、离心、弃上清，获得羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀；b.用1～1.5倍体积20mMpH6.0的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀，并加入1～1.5倍体积的水溶性炭化二亚胺，室温下搅拌20～30分钟，最后用2～3倍体积0...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁晓辉，毛远丽，
申请(专利权)人：上海凯创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31