一种军团菌快速检测与分型的引物及方法技术

本发明专利技术属于微生物分子检测领域，尤其涉及一种军团菌快速检测与分型的引物及方法。本发明专利技术提供的军团菌快速检测与分型的引物，包括军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物。本发明专利技术提供的引物具有特异性强和准确性高的优点，使用该特异性引物可以一步快速检测出是否含有军团菌，同时还可以鉴别出军团菌是嗜肺军团菌还是非嗜肺军团菌，无需进行多次凝胶电泳分析，节省成本，操作简便，而且检测结果准确，是一种理想的军团菌快速检测与分型的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种军团菌快速检测与分型的引物及方法
本专利技术属于微生物分子检测领域，尤其涉及一种军团菌快速检测与分型的引物及方法。
技术介绍
军团菌是一种胞内寄生的革兰阴性杆菌，在土壤和水系统中广泛存在。目前军团菌属有52种包括70多个血清型，并不断有新的菌种从环境中分离。近年来发现，约有一半的军团菌种与人类疾病有关，其中80%以上的军团菌感染是由嗜肺军团菌引起。军团菌通过空气以气溶胶的形式感染人，引起军团菌性肺炎，严重威胁人类的健康。因此，建立一种能检测军团菌和快速鉴别嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌的方法具有重要的临床意义。目前对军团菌的检测鉴定方法主要有血清抗体检测、尿可溶性抗原检测、军团菌分离培养等。但是上述的检测方法存在检测时间长、阳性率低、培养基的配置复杂和价格昂贵的缺陷，不利于军团菌的快速检测。近年来，分子生物学的发展为微生物的分类鉴定工作提供了较简便和准确的方法。PCR方法具有很高的特异性与敏感性，其主要是通过检测军团菌中的特异基因，以达到快速检测军团菌的目的。中国专利申请201410607389.6公开了一种快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团菌的三重PCR检测方法，所述检测方法主要是针对军团菌种属、嗜肺军团菌种和嗜肺军团菌I型的16SrRNA、danI和ORF9三个基因的引物，对dNTPs和引物浓度比例以及退火温度进行优化，建立快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团菌的三重PCR方法，该检测方法可以对分离培养到的可疑军团菌菌株进行快速有效的判定。但是，该检测方法只对可疑军团菌菌株进行分型，而且是利用了三个基因靶点，检测范围较狭窄，特异性不强，不利于该检测方法的推广和应用。中国专利CN101717815B公开了一种军团菌快速检测与分型方法，该方法是以基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳分析，对检测出阳性PCR产物进行酶切反应，对酶切反应产物作琼脂糖凝胶电泳分析进行分子分型。该检测方法能够检测出军团菌，且能将其分子分型为嗜肺军团菌或非嗜肺军团菌。但是，该检测方法的军团菌分型需要进行多次琼脂糖凝胶电泳分析，操作比较繁琐，大大限制了该检测方法的应用。
技术实现思路
为解决现有技术中军团菌的检测方法存在检测范围窄、操作繁琐的缺陷，本专利技术提供一种军团菌快速检测与分型的引物及方法，以解决上述问题。本专利技术提供一种军团菌快速检测与分型的引物，其包括军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物，所述军团菌属特异引物为：GL261F：5’-GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’(SEQIDNO.1)，GL261R：5’-CGATCTCTACGCATTTCACCG-3’(SEQIDNO.2)；所述嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物为：LP-A628R：5’-GTCAACCAGTATTATCTGACCGT-3’(SEQIDNO.3)，LP-C629F：5’-CTGGGCTTAACCTGGGAC-3’(SEQIDNO.4)。进一步地，所述军团菌属特异引物与嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物的浓度比为1-3：1-3，所述军团菌属特异引物与嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物的浓度比优选为2：1。进一步地，所述军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物的靶基因为16SrRNA基因。另外，本专利技术还提供了一种军团菌快速检测与分型的方法，包括如下步骤：S1应用细菌基因组DNA提取液提取待测标本中的细菌基因组DNA；S2以细菌基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物进行PCR扩增；S3将阳性对照和阴性对照进行PCR扩增；S4将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。进一步地，所述步骤S1中细菌基因组DNA提取液的配方为：Chelex100resin5%；Tris-HCl10mM，pH8.3；乙二胺四乙酸二钠0.1mM；叠氮钠0.1%；蛋白酶K200μg/ml。进一步地，所述步骤S2中的PCR扩增反应条件包括：阶段1：94℃3min；阶段2：94℃20s；阶段3：59℃20s；阶段4：72℃25s；35个循环；阶段5：72℃5min；在4℃保温。进一步地，所述步骤S2中军团菌属特异引物扩增序列为261bp。其中，GL261F-GL261R引物对扩增序列为军团菌属16SrDNA基因一段保守序列，具体序列如下：GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCG。进一步地，所述步骤S2中肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物分别与军团菌属特异引物配对扩增261bp内的一段序列；GL261F-（LP-A628R）引物对扩增片段为203bp；（LP-C629F）-GL261R引物对扩增序列为97bp。其中，GL261F-（LP-A628R）引物对扩增片段亦为军团菌属16SrDNA基因一段保守序列为上述261bp片段内的一段203bp序列，具体序列如下：GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAGTTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGAC；（LP-C629F）-GL261R引物对扩增序列亦为军团菌属16SrDNA基因一段保守序列为上述261BP片段内的一段97bp序列，具体序列如下：CTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCG。进一步地，所述步骤S3中阳性对照包含嗜肺军团菌基因组DNA、军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物，所述军团菌基因组DNA核苷酸序列在NCBI基因库上编号为NR_074231。更进一步地，所述步骤S3中阴性对照包含军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物。本专利技术提供的军团菌快速检测与分型的方法是利用等位基因特异性PCR原理，利用等位基因上一两个碱基的差异，特异扩增其中一个等位基因的技术。其主要原理是利用一对特异与其中一条等位基因完全互补的引物，而与另外一条等位基因在3’端不互补的引物进行基因扩增，从而达到鉴别的效果。专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种军团菌快速检测与分型的引物，其特征在于，包括军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物，所述军团菌属特异引物为：GL261F：5’‑GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC‑3’，GL261R：5’‑CGATCTCTACGCATTTCACCG‑3’；所述嗜肺军团菌16s rRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物为：LP‑A628R ：5’‑GTCAACCAGTATTATCTGACCGT‑3’，LP‑C629F ：5’‑ CTGGGCTTAACCTGGGAC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种军团菌快速检测与分型的引物，其特征在于，包括军团菌属特异引物和嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸多态性位点特异引物，所述军团菌属特异引物为：GL261F：5’-GGAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’，GL261R：5’-CGATCTCTACGCATTTCACCG-3’；所述嗜肺军团菌16srRNA基因单核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹晓勇，朱庆义，胡朝晖，梁耀铭，
申请(专利权)人：广州金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44