一种嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用途制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别是涉及一种嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用途。本发明专利技术提供一种嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有LP抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。本发明专利技术所提供的检测试剂盒以患者的尿液或痰液作为检测样本，结合近红外荧光检测技术，可快速，准确的检测出患者标本中特异性、可溶性LP抗原。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用途。
技术介绍
军团菌属的模式菌是嗜肺军团菌(LegionellaPneumophila)，占军团菌的90％(路凤，程义斌，王仲，等.呼吸系统疾病就诊患者嗜肺军团菌感染的流行病学调查[J].环境与健康杂质，2012,27(3)：203-205)，其散发病例占社区获得性肺炎的1％-15％、医院内感染肺炎的3.8％、诊断困难的不典型肺炎的4％-11％(陆风，金银龙，程义斌，等.军团菌病的流行概况[J].国外医学：卫生学分册，2008,35(2)：78)。军团病(Legionnairesdisease)主要是由嗜肺军团菌引起的一种细菌性呼吸道传染病。针对尿液中LP抗原的检测方法主要有RIA、及EIA等(张旭，马妮，郑洪.环境中军团菌快速检测方法的研究进展.[J].中国卫生检验杂志，2009,19(1)：210-241)。但是，RIA法具有放射性，EIA耗时较长且感染初期血清中抗体含量达不到检测水平，不适合临床检测应用。我国现阶段对于嗜肺军团菌的检测技术水平仍相对滞后(朱家馨，陈文思，黄静，等.一种国产嗜肺军团菌抗原检测试剂盒的初步评价[J].实用医学杂志，2010,26(9)：1637-1638)。因此，开发一种可以快速准确的检测嗜肺军团菌的方法已成为临床检测研究中亟待解决的问题。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用途，用于建立高效可行的嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测技术，解决现有技术中的问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有LP抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。优选的，所述免疫荧光探针为LP抗体包被的近红外荧光乳胶微球颗粒。更优选的，所述荧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm。近红外光(NIR)，是介于可见光(VIS)和中红外光(MIR)之间的电磁波，ASTM定义NIR为波长在780nm-2526nm范围内的电磁波。在近红外光区，生物体自吸收或荧光强度很小，可避免背景干扰。同时由于散射光强度与波长的四次方呈反比，近红外区的散射干扰大为减少。本专利技术第二方面提供所述嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：1)用磷酸盐缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散(将荧光乳胶微粒用PH7.3，0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液清洗，10000rpm离心10min，离心后的沉淀物用磷酸盐缓冲液复溶，并用超声波细胞粉碎机将乳胶微粒分散，此步骤重复两次)，在清洗好的乳胶颗粒中加入LP抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入乙醇胺封闭乳胶颗粒上多余的基团，制备获得探针溶液；2)利用微量蛋白点膜系统将含有LP抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用；3)用制备好的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，真空干燥机中干燥备用；4)将包被LP抗体的硝酸纤维素膜、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒。优选的，所述步骤1中，磷酸盐缓冲液为0.009-0.011mol/L，PH7.25-7.35的磷酸盐缓冲液。优选的，所述步骤1中，荧光乳胶微粒的直径为140-160nm。优选的，所述步骤1中，乳胶颗粒、LP抗体、EDCA的重量比为9-11：0.9-1.1：0.9-1.1。在本专利技术一实施例中，乳胶颗粒、LP抗体、EDCA的投料量分别为1mg、100ug、100ug。所述步骤1中乙醇胺的加入量为适量，本领域技术人员可根据实际情况调整乙醇胺的用量。优选的，所述步骤2中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。本领域技术人员可选取适当浓度和pH的PBS缓冲液。优选的，所述步骤2中，含有LP抗体的缓冲溶液中LP抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml。优选的，所述步骤2中，LP抗体的喷加量为0.9-1.1ul/cm。优选的，所述步骤2中，烘干的具体条件为36-38℃烘箱烘干。优选的，所述LP抗体的制备方法如下：1)抗原的制备：将嗜肺军团菌菌株接种在培养基上，培养后用生理盐水从平板上洗脱细菌，离心获取菌泥(同时去除平板被洗脱的液体成分)，菌泥加适量PBS缓冲液超声破裂，过阴离子柱纯化，用NaCl水溶液洗涤，再用NaCl水溶液洗脱，洗脱液装透析袋，用PEG包埋吸水浓缩，获取抗原；优选的，所述嗜肺军团菌菌株购自ATCC。优选的，所述抗原的制备过程中的培养条件具体为：37℃、5％CO2的条件下培养，3-5天后洗下菌苔。优选的，所述抗原的制备过程中的培养基为缓冲活性碳酵母琼脂培养基(BCYE)。优选的，所述离心获取菌泥的条件为4500-5500rpm。优选的，所述用NaCL水溶液洗涤时，NaCl的溶液浓度为45-55mM。优选的，所述用NaCl水溶液洗脱时，NaCl的溶液浓度为135-165mM。2)单克隆抗体的制备：动物免疫：对小鼠进行免疫；优选的，所述对小鼠进行免疫具体包括如下步骤：第一次免疫时抗原加等量的福氏完全佐剂充分乳化，第二次及第三次抗原加等量福氏不完全佐剂充分乳化，细胞融合前腹腔直接注射抗原加强免疫，一免抗原加福氏完全佐剂，皮下免疫，抗原量为0.1mg/鼠，15天后2免，皮下免疫抗原加福氏不完全佐剂，抗原量为0.2mg/鼠，25天后三免抗原加福氏不完全佐剂，皮下免疫，抗原量为0.2mg/鼠，10天后剪尾巴取血测ELISA效价，选取效价大于10万倍的小鼠进行加强免疫，水剂腹腔注射抗原1mg/鼠，三天后取脾脏细胞融合；细胞融合：处死小鼠，无菌操作取出脾脏，制备B淋巴细胞悬浮液，将B淋巴细胞与准备好的处于对数生长期的同系SP2/0骨髓瘤细胞混合，制备杂交瘤细胞，并进行杂交瘤细胞筛选；优选的，所述单克隆抗体的制备过程中杂交瘤细胞筛选的具体方法为：用HAT培养基培养细胞，2周后即可筛选出骨髓瘤细胞与B淋巴细胞的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞的克隆化：克隆细胞生长的各个孔检测100％抗体阳性为止；优选的，所述克隆化的方法是有限稀释法。抗体的制备：将小鼠首先腹腔注射石蜡，1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞，1-2周后，用注射器抽取腹水，纯化后即可获得大量的单克隆抗体。优选的，所述腹腔内接种杂交瘤细胞时，将杂交瘤细胞浓度调节到1×105个/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有LP抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。

【技术特征摘要】
1.一种嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端
开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有LP抗体的硝酸纤维素
膜和吸水纸。
2.如权利要求1所述的一种嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒，其特征在于，所述免疫
荧光探针为LP抗体包被的近红外荧光乳胶微球颗粒。
3.如权利要求1-2任一权利要求所述的嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒的制备方法，
包括如下步骤：
1)用磷酸盐缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒中
加入LP抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入乙醇胺封闭乳胶颗粒上多余的基团，
制备获得探针溶液；
2)利用微量蛋白点膜系统将含有LP抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用；
3)用制备好的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，真空干燥机中干燥备用；
4)将包被LP抗体的硝酸纤维素膜、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸
水纸及背板组装制备成嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒。
4.如权利要求3所述的嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所
述步骤1中，荧光乳胶微粒的直径为140-160nm。
5.如权利要求3所述的嗜肺军团菌抗原近红外荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所
述步骤1中，乳胶颗粒、LP抗体、EDCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜小华，
申请(专利权)人：中国人民解放军第八五医院，
类型：发明
国别省市：上海;31