本发明专利技术公开了一种DNA测序模板的制备方法。该方法包括如下步骤：（1）将待测序的DNA分子依次进行片段化、末端修复和补齐，3’端加A，以及连接接头；（2）通过三轮半巢式PCR扩增富集目的DNA片段；前两次PCR所用引物均为一条特异性引物和一条通用引物；第三次PCR所用引物由两条通用引物组成；前两次PCR可为多重PCR反应。与Illumina?GA样品前处理过程相比，本发明专利技术所提供的方法减少了样品处理的步骤，节约了时间和经济成本，同时降低了起始DNA样品的需求量；最重要的是，循环数的降低和Phusion高保真DNA聚合酶的使用降低了由于PCR而引入的突变，使得对所得数据的处理变得相对简单清晰，同时本方法在应用到各种重测序的实验中时对测序深度的要求也降低。
【技术实现步骤摘要】
—种用于新一代测序分析的多重目的DNA片段富集方法
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种DNA测序模板的制备方法，特别涉及一种用于新一代测序分析的目的DNA片段的富集方法。
技术介绍
新一代测序技术(Next Generation Sequencing, NGS)是近年来新兴的一系列测序技术的总称，他们都是基于边合成边测序(Sequencing by Synthesis)的原理,具有高通量、时间短、数据量庞大的特点，已经被广泛应用于基因组(重)测序、转录组测序、单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)开发等等方面,成为人们研究分子生物学、分子遗传学等等的有力工具。在多种新一代测序技术中，Illumina公司开发的基因组分析仪(GenomeAnalyzer, GA)由于具有成本相对较低、通量大、前处理较为简单等等优势,成为目前应用的最为广泛的技术之一。Illumina GA的DNA样品前处理过程主要包括:(I) DNA样品的片段化；(2)修复并补齐末端，以及3’端加A (腺嘌呤脱氧核苷酸)；(3)连接接头；(4)切胶纯化；(5)使用Illumina公司提供的引物进行18个循环的PCR扩增；(6)切胶纯化；(7)样品质量监控(纯度、浓度等)。随后即可上机进样开始测序。Illumina GA的DNA样品前处理方法不具有选择性，因此，若只关注基因组(或转录组)中某一特定区域的序列，则需要在进行Illumina GA样品前处理之前完成选择性富集的过程。目前通用的选择性富集 方法有:聚合酶链式反应(PCR):通过使用特异性引物对目的片段进行选择性扩增。水相杂交:如MIP (molecular inversion probe),通过带有特异序列的探针与基因组样品杂交后，连接成环并扩增，获得目的片段；或使用生物素标记的RNA探针与基因组碎片杂交，而后通过磁珠吸附生物素进而将特异序列与基因组碎片分离，而后进行富集。固相杂交:使用类似于DNA微阵列(Microarray)处理的方法,在固相支持物上固定特异的探针序列来捕获目的片段上述二种方法都是在进行Illumina GA样品如处理之如完成的,其中水相杂交和固相杂交涉及的技术相对复杂，成本不菲(尤其是DNA微阵列的固相支持物的获得需要大量合成的特异序列)，需要的起始基因组DNA用量很大，且在处理后仍需要对获得的目的片段进行富集(通常也是靠PCR)。而PCR虽然是一种具有良好选择性并且技术要求较低的方法，但是其扩增中会发生碱基的突变，虽然使用高保真的聚合酶能够改善突变发生的频率，但是随着扩增循环数的增加，碱基突变的概率会愈加提高。由于Illmunia GA样品前处理中有18个循环的PCR扩增，在Illumina GA样品前处理之前的PCR反应过程中引入的碱基突变会在随后的Illumina GA的样品前处理中被放大，并且测序得到的突变碱基的测序质量与未突变碱基的测序质量没有显著差异，无法分辨，这在检测点突变(point mutation)或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)的时候会对结果产生很大干扰，造成过多的假阳性结果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种DNA测序模板的制备方法，所述DNA测序模板适宜采用Illumina公司的GA测序仪进行测序。 本专利技术所提供的DNA测序模板的制备方法，具体包括如下步骤:(I)将具有待测序位点的DNA样品依次进行片段化、末端修复和补齐，3’端加A，以及连接接头，得到用于第一次PCR反应的模板；所述待测序位点的上游核苷酸序列为已知，且存在PCR特异引物对应的特异区域；所述待测序位点可以为一个也可为多个。所述接头为由长链和短链组成的一端是平末端另一端是5’粘性末端的双链DNA，所述长链的5’端突出；在实际应用中，可通过化学合成得到组成所述接头的所述长链和所述短链，再自行变性退火后得到所述接头。(2)用特异性引物Iros和通用引物I对步骤(1)得到的用于第一次PCR反应的模板进行第一次PCR扩增，得到包含所述待测序位点的DNA片段；所述特异性引物Iros与所述特异区域互补；所述通用引物I的序列含有选自步骤(I)所述接头中所述长链的5’端突出部分的序列。当对多个位点或区域进行同时检测时，应保持各引物的退火温度一致，这将有利于多重PCR反应的进行。(3)用特异性引物2ros和通用引物2对步骤(2)得到的所述DNA片段进行第二次PCR扩增，得到包含所述待测序位点的DNA片段；所述特异性引物2ros自5’端至3’端分为片段I和片段2，所述片段2与所述特异区域互补，且所述特异性引物2ros自3’端起第一个核苷酸与所述待测序位点之间的距离比所述特异性引物Iros自3’端起第一个核苷酸与所述待测序位点之间的距离更近；所述片段I与所述待测序位点的上游不互补；所述通用引物2的序列为选自步骤(1)所述接头中所述长链的5’端突出部分的序列。当对多个位点或区域进行同时检测时，应保持各引物的退火温度一致，这将有利于多重PCR反应的进行。(4)用通用引物3和通用引物4对步骤(3)得到的所述DNA片段进行第三次PCR扩增，得到DNA测序模板；所述通用引物3的自5’端至3’端分为片段3和片段4，所述片段4为选自步骤(3)所述片段1，所述片段3为如下a):a) AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCC (固相支持物结合区域)所述通用引物4自5’端至3’端分为片段5和片段6，所述片段6选自步骤(1)所述接头中所述长链的5’端突出部分的序列，所述片段5为如下b):b) CAAGCAGAAGACGGCATA (固相支持物结合区域)。经过上述步骤的处理后，所得DNA测序模板还需经过标准样品纯化处理、纯度、浓度鉴定等步骤后可用于Illumina GA测序。为了增加测序的准确性，减少扩增中随机错配的出现，上述步骤中的三次PCR反应均使用Phusion高保真聚合酶。在本专利技术的一个实施例中，所述接头中所述长链的序列具体如序列表中序列1-10所示，所述接头中所述短链的序列为如下中的任一种:A)序列表中序列I的自3’端起倒数第9位-倒数第2位的反向互补序列；B)序列表中序列2-序列10中任一个的自3’端起倒数第10位-倒数第2位的反向互补序列。在本专利技术的一个实施例中，用于所述第一次PCR反应的所述通用引物I序列具体为序列表中序列11。在本专利技术的一个实施例中，用于所述第二次PCR反应的所述通用引物2序列具体为序列表中序列12。[0031 ] 在本专利技术的一个实施例中，用于所述第三次PCR反应的所述通用引物3和所述通用引物4的序列具体分别为序列表中序列13和序列14。通常情况下，上述步骤中所述第一次PCR反应进行10-15个循环的扩增；所述第二次PCR反应进行10-15个循环的扩增；所述第三次PCR反应进行15-18个循环的扩增。在本专利技术的实施例中，所述第一次PCR反应具体进行了 15个循环的扩增；所述第二次PCR反应进行了 15个循环的扩增；所述第三次PCR反应进行了 18个循环的扩增。本专利技术针对Illumina GA样品前处理的过程进行改进，得到本文档来自技高网...
【技术保护点】
DNA测序模板的制备方法，包括如下步骤：（1）将具有待测序位点的DNA样品依次进行片段化、末端修复和补齐，3’端加A，以及连接接头，得到用于第一次PCR反应的模板；所述待测序位点的上游核苷酸序列已知，且存在PCR特异引物对应的特异区域；所述接头为由长链和短链组成的一端是平末端另一端是5’粘性末端的双链DNA，所述长链的5’端突出；（2）用特异性引物1ros和通用引物1对步骤（1）得到的用于第一次PCR反应的模板进行第一次PCR扩增，得到包含所述待测序位点的DNA片段；所述特异性引物1ros与所述特异区域互补；所述通用引物1的序列含有选自步骤（1）所述接头中所述长链的5’端突出部分的序列；（3）用特异性引物2ros和通用引物2对步骤（2）得到的所述DNA片段进行第二次PCR扩增，得到包含所述待测序位点的DNA片段；所述特异性引物2ros自5’端至3’端分为片段1和片段2，所述片段2与所述特异区域互补，且所述特异性引物2ros自3’端起第一个核苷酸与所述待测序位点之间的距离比所述特异性引物1ros自3’端起第一个核苷酸与所述待测序位点之间的距离更近；所述片段1与所述待测序位点的上游不互补；所述通用引物2的序列选自步骤（1）所述接头中所述长链的5’端突出部分的序列；（4）用通用引物3和通用引物4对步骤（3）得到的所述DNA片段进行第三次PCR扩增，得到DNA测序模板；所述通用引物3的自5’端至3’端分为片段3和片段4，所述片段4选自步骤（3）所述片段1，所述片段3为如下a）：a）AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCC；所述通用引物4自5’端至3’端分为片段5和片段6，所述片段6选自步骤（1）所述接头中所述长链的5’端突出部分的序列，所述片段5为如下b）：b）CAAGCAGAAGACGGCATA。...
【技术特征摘要】
1.DNA测序模板的制备方法，包括如下步骤: (1)将具有待测序位点的DNA样品依次进行片段化、末端修复和补齐，3’端加A，以及连接接头，得到用于第一次PCR反应的模板； 所述待测序位点的上游核苷酸序列已知，且存在PCR特异引物对应的特异区域； 所述接头为由长链和短链组成的一端是平末端另一端是5’粘性末端的双链DNA，所述长链的5’端突出； (2)用特异性引物Iros和通用引物I对步骤(1)得到的用于第一次PCR反应的模板进行第一次PCR扩增，得到包含所述待测序位点的DNA片段； 所述特异性引物Iros与所述特异区域互补；所述通用引物I的序列含有选自步骤(1)所述接头中所述长链的5’端突出部分的序列； (3)用特异性引物2ros和通用引物2对步骤(2)得到的所述DNA片段进行第二次PCR扩增，得到包含所述待测序位点的DNA片段； 所述特异性引物2ros自5’端至3’端分为片段I和片段2，所述片段2与所述特异区域互补，且所述特异性引物2ros自3’端起第一个核苷酸与所述待测序位点之间的距离比所述特异性引物Iros自3’端起第一个核苷酸与所述待测序位点之间的距离更近；所述片段I与所述待测序位点的上游不互补；所述通用引物2的序列选自步骤(1)所述接头中所述长链的5’端突出部分的序列； (4)用通用引物3和通用引物4对步骤(3)得到的所述DNA片段进行第三次PCR扩增，得到DNA测序...
【专利技术属性】
技术研发人员：漆小泉，池旭，张英春，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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